中医证候动物模型的方案设计中，经常会出现这样一套分组：

正常组、疾病组、证候组、病证结合组。

四个组看起来结构完整，既有疾病对照，也有证候对照，还能观察病与证叠加后的变化。因此，不少项目会直接把这套分组作为病证结合研究的标准模板。

但真正进入实验后，问题很快就会出现。

证候组究竟是在复制一个相对独立的证候，还是只接受了寒冷、潮湿、疲劳、束缚、饮食失节等证候诱导因素？

疾病组与病证结合组的疾病严重程度是否一致？

病证结合组表现得更重，是因为证候形成，还是因为多叠加了一套刺激，造成了更强的非特异性损伤？

候选药改善病证结合组后，究竟证明了疾病治疗作用、证候改善作用，还是只是在对抗额外的造模刺激？

如果这些问题没有提前定义，四个组全部保留，也未必能够形成完整证据。相反，动物数量增加、终点增多、组间比较复杂，却仍然无法解释药物为什么有效。

正常组、疾病组、证候组和病证结合组并不是固定搭配。每个组都承担一个特定的因果问题：

正常组提供健康基线；

疾病组回答单纯疾病能够造成哪些变化；

证候组回答证候诱导因素本身会带来什么影响；

病证结合组则用于评价疾病背景叠加特定证候后的整体状态。

只有当项目需要同时拆分疾病效应、证候因素效应及二者交互作用时，四个组才具有完整保留的价值。

如果项目只想评价一个候选中药对已经验证成熟的病证结合模型是否有效，机械保留全部四组，可能并不是最优设计。

分组的核心不在于数量多，而在于每个组能否排除一种关键解释。

1、正常组：提供未经疾病和证候造模干预的基础状态

正常组通常不接受疾病造模，也不接受证候诱导因素，主要用于建立动物在正常饲养条件下的行为、生理、生化、病理及分子基线。

以慢性疲劳、寒湿刺激、高脂饮食、束缚应激与某种疾病模型组合为例，正常组可以帮助判断模型动物的体重、摄食、活动、体温、代谢、炎症和器官功能偏离正常水平的程度。

正常组回答的是“动物偏离健康状态多远”。

它不能单独解释这种偏离来自疾病、证候，还是二者叠加。

2、疾病组：只接受现代疾病模型相关干预

疾病组接受手术、药物、免疫、感染、饮食或遗传等疾病造模因素，但不额外叠加证候诱导因素。

这一组的主要价值，是建立疾病本身的病理和功能变化。

当疾病组与病证结合组进行比较时，可以进一步判断叠加证候因素后，模型是否出现了超出单纯疾病的变化。

因此，疾病组回答的是“没有额外证候诱导时，疾病本身会发展到什么程度”。

3、证候组：只接受证候相关诱导因素

证候组通常不建立目标疾病，只接受与证候相关的干预，例如寒冷、潮湿、劳倦、饥饱失常、情志应激、睡眠干扰或特定药物刺激。

这一组用于判断证候诱导因素本身会改变哪些指标，以及这些变化在没有目标疾病的情况下能否出现。

不过，“证候组”这个名称需要谨慎使用。

如果动物只是接受了低温、束缚、疲劳或特殊饮食，但尚未形成经过评价体系确认的稳定证候，将其命名为“证候组”容易提前下结论。

更严谨的名称可以是“证候因素组”“证候诱导组”或“证候造模因素组”。

只有当动物在宏观表征、功能指标、客观检测和方药反证等多个层面符合预设证候标准时，才适合进一步讨论其是否构成相对独立的证候模型。

4、病证结合组：同时接受疾病和证候相关造模

病证结合组是中药药效评价中最常使用的核心模型组。

这一组既具有目标疾病的病理基础，又叠加了与拟定中医证候相符的诱导因素，用于模拟某一疾病处于特定证候状态时的整体表现。

病证结合组需要同时满足两套标准：疾病模型成立，目标证候也成立。

如果疾病指标没有达到标准，只能说明证候因素造成了整体状态变化；如果证候指标没有形成稳定差异，则该组更接近一个经过复杂干预的疾病模型。

正常组、疾病组、证候组和病证结合组，可以被理解为两个造模因素的组合。

第一个因素是有无疾病造模。

第二个因素是有无证候相关诱导。

由此形成四种状态：

正常组：无疾病、无证候诱导；

疾病组：有疾病、无证候诱导；

证候因素组：无疾病、有证候诱导；

病证结合组：有疾病、有证候诱导。

这套设计的价值，在于能够分别分析三个问题。

第一个问题是疾病造模本身产生了什么作用。

第二个问题是证候诱导因素本身产生了什么作用。

第三个问题是证候因素叠加到疾病背景后，是否产生了简单相加之外的交互作用。

例如，寒冷刺激在正常动物中可能只造成轻度活动减少，但叠加到关节炎模型后，可能明显放大疼痛、循环障碍或局部炎症。

这种结果提示寒冷因素的影响依赖疾病背景。

如果病证结合组的变化只是疾病组变化与证候因素组变化的简单叠加，研究重点更偏向两个因素共同作用。

如果病证结合组出现了两个单因素组都没有的新表型，或者某一指标被明显放大，才更值得进一步研究病与证之间的交互机制。

因此，四组设计适合回答模型构建和病证关系问题。

但进入候选药药效评价后，项目未必仍然需要完整重复这套结构。

1、正式药效实验通常应保留正常组

正常组能够提供体重、摄食、行为、器官功能、病理结构和生化指标的健康范围。

候选药治疗后，相关指标恢复到正常组附近，说明模型异常得到较充分改善；如果明显超过正常范围，还需要考虑药物是否造成过度干预。

正常组还可以帮助发现候选药在健康动物中的潜在影响。

不过，正常组通常不接受候选药，因此不能替代专门的正常动物给药组或安全性研究。

2、正常组无法区分疾病和证候的贡献

病证结合组与正常组存在显著差异，只能证明复合造模改变了动物状态。

这项比较无法说明疾病模型是否成立，也无法说明目标证候是否成立。

如果研究只设置正常组和病证结合组，再加入候选药组，能够评价候选药是否改善复合模型，却无法解释药物主要作用于疾病层面还是证候层面。

3、模型验证阶段不能只用正常组作对照

中医证候动物模型容易出现一个问题：病证结合组几乎所有指标都比正常组更差，于是研究者认为模型构建成功。

严重度增加并不等于证候特异性提高。

造模因素过多、刺激过强、动物一般状态恶化，同样会使体重、活动、摄食、体温、炎症和器官功能全面异常。

模型验证需要疾病组或证候因素组帮助拆分这些变化，不能仅依靠正常组与病证结合组之间的差异。

1、疾病组用于回答“叠加证候后增加了什么”

很多疾病模型本身已经会出现与某些中医证候相似的表现。

慢性心肺疾病可能自然伴随活动下降和耐力降低；代谢性疾病可能自然出现肥胖、乏力和脂代谢异常；慢性炎症模型也可能出现体重下降、被毛改变和摄食减少。

如果没有疾病组，这些表现容易全部被归入证候。

保留疾病组后，研究者才能判断病证结合组是否出现了新的表征，或者原有表征是否形成了具有方向性和稳定性的放大。

2、疾病组是方证特异性研究的重要参照

假设候选方剂在病证结合组中有效，仅凭这一结果还不能判断其作用是否依赖目标证候。

药物可能对该疾病本身就具有普遍治疗作用。

如果同一候选方在疾病组中作用较弱，在病证结合组中作用更强，并且这种差异能够通过暴露、药效和功能指标得到支持，才更有利于讨论方证匹配带来的增量价值。

3、疾病组可以帮助发现证候造模造成的非特异性加重

病证结合组的疾病终点明显重于疾病组时，需要分析差异来源。

一种可能是目标证候确实改变了疾病进程。

另一种可能是证候造模因素直接干扰了疾病终点。

例如，疲劳刺激会直接影响运动能力，束缚应激会改变激素和免疫反应，低温可能影响循环和疼痛，高脂饮食会直接改变代谢及炎症。

只有保留疾病组，并进一步设置证候因素组或造模因素对照，才能判断加重结果是否具有证候解释。

4、疾病组并非每次正式药效实验都必须保留

如果某一病证结合模型已经通过前期研究完成了构建、验证和批次稳定性确认，后续项目只想评价候选药在该模型中的剂量—效应关系，疾病组可以根据研究目标适当精简。

此时最小药效框架通常包括正常组、病证结合模型组、阳性对照组和候选药不同剂量组。

但项目如果准备提出“候选药主要适用于某证型”“目标证候能够提高药物响应”或“候选药具有明确方证优势”等结论，疾病组仍然具有较高价值。

1、证候诱导因素不等于证候已经成立

寒冷、潮湿、劳倦、束缚、睡眠剥夺和饮食改变属于造模手段。

这些手段能够引起与某类证候相关的表型，但手段本身不能直接替代证候评价。

例如，动物接受低温刺激后出现体温下降，并不能仅凭这一项指标定义为寒证；动物接受疲劳刺激后运动能力下降，也不能仅凭运动耐力判断气虚证形成。

证候组需要预设明确的成功标准。

评价通常需要结合一般状态、行为功能、客观生理指标、与证候相关的多系统变化及方药反证，避免通过单一指标命名证候。

2、部分证候无法脱离疾病背景独立复制

中医证候反映的是疾病发展一定阶段的病位、病性和整体反应状态。

部分证候可以通过相对独立的病因病机刺激进行模拟，另一些证候则高度依赖具体疾病背景。

如果脱离目标疾病后，所谓“证候组”只能复制疲劳、寒冷、应激或代谢异常，未必能够完整对应临床证候。

此时更适合把该组定义为证候诱导因素对照，主要用于排除造模因素的直接影响，而不必强行证明其构成完整的独立证候。

3、证候组是否保留取决于研究问题

研究证候模型构建方法时，证候因素组通常需要保留。

研究某种证候诱导因素如何改变疾病进展时，也需要保留。

单纯开展成熟病证结合模型中的候选药药效评价时，证候组的优先级通常低于疾病组。

因为候选药未来面向的目标人群一般是患有目标疾病并符合特定证候的患者，而不是没有疾病、只表现出某种证候状态的个体。

4、证候组不能使用完全不同的造模强度

如果证候组接受一种强度的寒湿、疲劳或应激刺激，病证结合组接受另一种强度，两组之间将无法直接比较。

证候相关因素的类型、强度、频率、持续时间和撤除时间应尽量一致。

病证结合组与证候因素组之间的主要差别，应集中在有无疾病造模。

1、疾病必须达到预设标准

病证结合组首先要完成目标疾病的构建。

疾病是否成立，需要通过适合该模型的功能、生化、影像、病理或行为指标确认。

不能因为动物出现了疲劳、畏寒、摄食下降或体重改变，就默认疾病模型也已经成功。

2、证候需要具有独立于疾病严重度的增量表现

病证结合组中的证候差异不能完全由病情更重来解释。

较合理的设计，是让疾病组与病证结合组在关键疾病基线上尽量接近，再观察病证结合组是否出现稳定的证候表征。

例如，两组在基础器官损伤或疾病评分相近的情况下，病证结合组出现了预设的整体状态、功能和客观指标组合，证候解释会更清晰。

3、模型应具有稳定时间窗口

病证结合模型可能在造模结束后快速恢复，也可能随疾病进展发生证候转化。

正式给药前需要明确证候何时形成、维持多久、撤除造模因素后是否持续，以及给药期间是否仍需保留证候刺激。

如果模型组在候选药尚未起效前已经自然恢复，最终观察到的改善就会混入较强的自发恢复效应。

4、阳性方应在合理条件下提供支持

经典方或临床常用方可以用于观察模型是否具备方药响应性。

不过，“以方测证”更适合作为支持证据，不能成为唯一判定标准。

如果一开始根据某方构建模型，随后又以同一方起效证明模型成立，容易形成循环论证。

模型应先通过预设证候标准确认，再利用对应方药的选择性反应补充证据。

1、首次建立或优化病证结合模型

项目首次构建某类病证结合模型时，需要回答疾病因素和证候因素各自造成什么变化。

正常组、疾病组、证候因素组和病证结合组能够形成相对完整的模型验证结构。

此时研究重点包括证候诱导因素是否有效、是否直接造成器官损伤、疾病与证候是否发生交互，以及病证结合组是否具有可重复的稳定表型。

2、需要证明证候因素会改变疾病进程

如果研究假设是寒、湿、痰、瘀、气虚、阳虚或其他证候相关因素能够促进某种疾病发展，仅比较疾病组与病证结合组还不够。

证候因素组可以帮助判断，该因素本身是否已经改变同一疾病终点。

四组同时存在时，更容易区分证候因素的独立作用和疾病背景下的交互作用。

3、需要分析疾病和证候的交互机制

研究目标如果包括病与证之间的关系，四组设计具有较高价值。

例如，某证候因素在正常动物中影响较小，进入疾病背景后却显著放大炎症、纤维化或代谢异常，这种现象需要通过完整的双因素分组进行验证。

4、需要建立可供后续项目使用的标准化模型

医药企业准备把某一病证结合模型作为长期研发平台时，前期最好完成一次较系统的四组验证。

通过这一步明确造模参数、证候形成时间、模型成功标准、疾病与证候指标、自然恢复速度和阳性药响应，后续候选药项目才有条件精简分组。

1、成熟模型中的基础药效方案

当病证结合模型已经完成验证，候选药项目主要回答“是否有效”和“有效剂量是多少”时，可采用较精简的方案：

正常组；

病证结合模型组；

阳性对照组；

候选药低、中、高剂量组。

这一设计适合筛选和剂量—效应评价，能够控制动物数量与项目成本。

它的解释边界也比较明确：候选药可以改善该病证结合模型，但不能据此单独证明证候选择性。

2、需要判断疾病治疗与证候改善时

如果企业希望区分候选药对疾病和证候的作用，可增加疾病组。

此时可以比较候选药在疾病组与病证结合组中的作用强度、起效速度和终点结构。

如果候选药只在病证结合组给药，药物对单纯疾病的作用仍然无法判断。

条件允许时，可以在疾病组中设置相同剂量的候选药，以直接比较不同模型背景下的药物响应。

3、证候因素组通常不进入每一轮正式药效实验

证候因素组主要承担模型验证和混杂因素排除任务。

若前期已经证明证候诱导本身不会造成目标疾病终点的主要变化，也不会直接干扰药效检测，后续正式药效实验可以不再重复设置。

如果项目更换了造模强度、动物品系、环境条件或给药周期，证候因素组的验证价值会重新上升。

4、分组精简不能牺牲核心解释

减少一个组之前，需要明确因此失去什么结论。

去掉疾病组后，无法评价证候因素带来的增量改变，也难以支持方证特异性。

去掉证候因素组后，无法在本批实验中独立排除证候诱导因素的直接影响。

去掉正常组后，无法判断模型和药物作用相对于健康水平的位置。

方案精简应围绕项目当前最重要的研发问题进行，而不能单纯根据动物成本决定。

1、方证对应需要比较不同证型背景下的药物响应

候选方在目标病证结合模型中有效，只能证明其对该模型具有药效。

要进一步讨论方证对应，需要观察同一候选方在单纯疾病模型、目标证型模型及非对应证型模型中的作用是否存在差异。

例如，同一种疾病可以建立寒证与热证、气虚与阴虚或痰湿与湿热等不同病证结合状态。

如果候选方在目标证型中药效更明确，而在非对应证型中作用减弱，方证选择性才更有说服力。

2、需要避免不同证型之间疾病严重度不一致

目标证型组药效更好，可能只是因为该组疾病较轻或药效观察空间更大。

不同病证结合组进入给药前，需要尽量平衡关键疾病指标。

证候差异应该建立在相近疾病负荷基础上。

3、可以加入对应方与非对应方参照

在条件允许时，目标证型模型中可设置对应方和非对应方，非对应证型模型中也设置相同参照。

这类交叉设计能够帮助判断药物作用来自普遍疾病改善，还是与证候背景存在匹配关系。

不过，分组数量会迅速增加。

企业项目需要先确定方证选择性是否属于当前开发阶段的核心问题，再决定是否开展完整交叉验证。

1、两组应尽量使用相同的疾病造模条件

疾病造模的剂量、手术方式、感染量、免疫方案、饲料条件和造模周期应保持一致。

病证结合组额外增加证候相关因素，不能同时改变疾病造模强度，否则无法判断最终差异来自哪一部分。

2、给药前应进行双重基线评价

疾病组和病证结合组需要先完成疾病指标评价。

病证结合组还要进行证候指标评价。

随机时应优先保证病证结合模型组、阳性组和候选药组之间的疾病严重度及证候严重度均衡。

如果需要直接比较疾病组与病证结合组，疾病核心指标也应尽量匹配。

3、不能只按体重随机

体重可以反映动物整体状态，但无法代表疾病负荷和证候程度。

有些证候造模本身会改变体重和摄食，单纯按体重随机反而可能掩盖模型差异。

更合理的方式，是根据疾病主指标、证候综合评分、体重及必要的功能指标进行分层随机。

4、需要预设入组和排除标准

动物应同时达到疾病和目标证候的基本标准后，再进入病证结合药效实验。

疾病成立但证候不足的动物，不能直接混入病证结合模型组。

证候表征明显但疾病造模失败的动物，也不适合继续纳入正式分析。

排除标准应在观察结果前确定，避免根据药效结果事后删除动物。

1、疾病指标用于评价目标适应症的核心病理

疾病指标应围绕目标疾病的功能、病理和临床转化价值设置。

不同适应症可采用器官功能、行为、影像、血液生化、组织病理及疾病相关分子指标。

这些指标主要回答候选药能否改变疾病进程。

2、证候指标用于评价目标证型是否形成和改善

证候指标可包括一般状态、活动、摄食、体温、耐力、睡眠、排泄、局部循环及与证候相关的客观生理变化。

指标需要与拟定证型的临床内涵和造模逻辑对应。

不能因为某一指标便于检测，就将其直接设为证候核心指标。

3、共同指标需要谨慎解释

体重、活动、炎症、激素和代谢指标，可能同时受到疾病和证候诱导影响。

这类指标可以作为综合评价的一部分，却不适合单独证明证候成立。

如果候选药改善共同指标，需要结合疾病专属终点和证候专属终点共同判断。

4、主要终点应在实验前明确

正式药效项目不宜把所有疾病和证候指标都视为同等重要。

建议提前划分主要终点、关键次要终点和支持性终点。

疾病治疗是产品核心定位时，疾病功能或病理指标通常应占据主要位置；产品明确强调证候改善时，可以增加预设证候主要终点，但仍需确认疾病结局不会因此恶化。

1、把证候因素组直接命名为证候模型组

动物接受了某种刺激，并不代表目标证候已经形成。组名应与证据强度一致。

2、病证结合组的疾病程度明显重于疾病组

此时药效差异可能由模型严重度、观察空间和自然进展速度造成，难以直接归因于证候。

3、证候造模因素直接影响主要药效终点

疲劳影响运动能力，束缚影响情绪行为，低温影响痛觉和循环，饮食改变影响代谢。相关终点必须设置独立对照或采用更具特异性的验证方式。

4、四个组使用不同的造模周期

疾病组、证候因素组和病证结合组若在不同日期结束造模，培养、饲养和年龄差异会进入结果。

各组应尽量采用时间匹配设计。

5、证候因素只在模型期存在，给药后立即全部撤除

证候因素撤除后，动物可能出现自然恢复。

如果候选药组与模型组的恢复速度不同，还需要判断这种差异来自药物作用，还是各组造模程度不一致。

正式实验前应明确给药期是否持续证候刺激，或者设置稳定的撤除和恢复窗口。

6、只证明病证结合组比正常组差

这种结果无法说明疾病模型、证候模型和病证结合关系是否成立。

7、候选药只在病证结合组给药，却宣称具有方证选择性

缺少疾病组、非对应证型或其他参照时，结论应限定为对该病证结合模型有效。

8、阳性方起效就直接认为证候成立

阳性方可能同时具有明确的疾病治疗作用。模型评价还需要依靠预设证候表征和客观指标。

9、为了结构完整机械增加四组

每增加一个组，都应对应一个需要回答的问题。无法改变研究结论的组别，只会增加动物消耗、统计比较和项目成本。

1、模型开发和平台建立阶段

建议优先采用正常组、疾病组、证候因素组和病证结合组。

这一阶段需要完成造模因素拆分、证候评价体系建立、疾病与证候交互分析、自然恢复观察和阳性方验证。

必要时可以设置不同证候造模强度和不同时间点，确定最稳定的模型窗口。

2、候选药初筛阶段

可以采用正常组、病证结合模型组、阳性对照组和候选药组。

候选药数量较多时，可先使用一个或两个剂量进行快速筛选，重点确认药效方向和基本耐受性。

该阶段不宜承担过多方证特异性结论。

3、候选药剂量—效应阶段

建议设置正常组、病证结合模型组、阳性组及候选药低、中、高剂量组。

如果需要判断目标证候是否改变药物响应，可增加疾病组及疾病背景下的候选药组。

4、方证选择性验证阶段

需要加入疾病组、目标病证结合组和非对应病证结合组，并根据研究目的设置对应方或非对应方参照。

重点比较同一候选药在不同证候背景下的药效强度和终点结构。

5、注册支持或关键决策阶段

分组应围绕产品拟定功能主治、目标人群和临床使用场景确定。

除了证明药物在病证结合模型中有效，还需要明确主要药效终点、剂量关系、起效时间、持续性、安全窗口及与阳性治疗的比较。

模型分组数量不必追求最多，但每个关键开发结论都应有对应的对照组支撑。

中医证候和病证结合动物模型的难点，往往不在于增加多少种造模因素，而在于能否把疾病、证候及造模刺激的直接影响拆分清楚。

博恩生物可根据候选药的功能主治、拟定适应症、中医证型、研发阶段和预期结论，协助设计正常组、疾病组、证候因素组、病证结合组、阳性对照组和候选药组的组合方式。

在模型设计层面，可围绕病因病机、现代疾病模型及病证结合思路，对造模顺序、刺激强度、持续时间、撤除时间和给药窗口进行评估，减少过度造模和非特异性损伤。

在模型验证层面，可分别评价疾病模型成立情况、证候表征、病证结合后的增量变化及造模因素的独立影响，并通过预实验确定模型形成时间、稳定窗口、自然恢复速度和批次接受标准。

在入组和随机层面，可根据疾病严重度、证候综合评价、体重和功能指标进行分层随机，避免只按体重分组造成疾病和证候基线不平衡。

在药效评价层面，可根据项目定位设置疾病主终点、证候终点和支持性指标，并开展一般状态、行为功能、生化、病理、免疫、炎症、代谢及相关机制检测。

在方证验证层面，可根据需要增加疾病组、目标证型组、非对应证型组、对应方和非对应方，评价候选药在不同模型背景中的药效差异，明确其作用更偏向疾病改善、证候改善还是方证匹配。

在项目实施层面，博恩生物可提供动物模型、给药、样本采集、病理、分子检测、统计分析和项目管理的一体化服务，并根据候选药的研发阶段调整方案颗粒度，避免早期筛选项目使用过于庞大的分组，也避免关键验证阶段因对照不足而失去解释力。

正常组、疾病组、证候组和病证结合组没有固定的取舍答案。

首次建立模型、验证证候因素或研究病证交互时，四组通常具有较高价值。

成熟模型中的候选药筛选和剂量评价，可以围绕正常组、病证结合模型组、阳性组和候选药组进行精简。

当项目希望进一步证明方证对应、证候选择性或证候因素对药物响应的影响时，疾病组、非对应证型组及相应给药组又需要重新加入。

合理的分组设计，应让每个组都排除一种可能的解释。

最终需要回答的并不是“四个组有没有全部设置”，而是疾病效应、证候因素效应、病证交互和候选药作用能否被清楚地区分。