偏头痛候选药做到动物阶段，硝酸甘油（NTG）和降钙素基因相关肽（CGRP）是两类非常常见的诱发方式。

两者都有人体诱发证据。

NTG可以在偏头痛患者中诱发延迟出现的偏头痛样发作，动物中则能够造成三叉神经血管系统激活、眶周和外周痛觉敏化、畏光等表型。单次NTG可以用于急性发作研究，反复NTG又能够进一步形成持续性的基础痛敏，因此已经发展出慢性偏头痛样模型。

CGRP的临床证据更加直接。CGRP输注可以在相当比例的偏头痛患者中诱发偏头痛样发作，CGRP及其受体又已经被gepants和单克隆抗体这两大类临床药物充分验证。在小鼠中，外周给予CGRP可以产生畏光、自发疼痛样面部表情以及一定条件下的机械痛敏。

所以企业项目很容易遇到一个问题：

既然CGRP本身已经是经过临床验证的偏头痛核心通路，为什么还要继续做NTG？

反过来，如果NTG能够同时带出NO信号、三叉神经敏化、CGRP释放和多个偏头痛相关表型，是不是直接做NTG就够了？

真正用于候选药开发时，两套模型承担的任务差别很大。

NTG更适合给候选药一个相对宽的偏头痛样病理背景，看看药物离开单一靶点以后还能不能稳定工作。CGRP模型则能够把疾病挑战集中到一条已经被临床充分验证的神经肽通路，因此非常适合做靶点验证、target engagement和CGRP轴候选物的早期药理确认。

这也意味着两套模型各自都有一个很典型的偏倚。

抗CGRP候选药在外源CGRP模型里获得强效，可能部分来自模型和靶点高度重合。作用NO-sGC-cGMP轴的候选物在NTG模型里同样可能拥有这种优势。

所以真正有开发价值的问题并非简单比较NTG和CGRP谁“更像偏头痛”。

需要先明确候选药准备治疗急性发作还是做长期预防，作用于CGRP轴还是更上游的三叉神经敏化，又准备通过什么临床给药方式进入患者。

模型应该服务于这些问题。

两种诱发物都可以在人体触发偏头痛样发作，但进入疾病通路的位置并不相同。

1、NTG更接近一个上游药理触发器

NTG进入体内以后释放NO，进一步影响cGMP相关信号、血管以及神经系统。

在偏头痛易感人群中，它能够诱发一个很有特点的双相过程。

最初可能出现短暂头痛和血管反应，经过一定潜伏期以后，一部分患者再出现更接近自身偏头痛的延迟发作。

这个潜伏过程很有价值。

它提示NTG并非单纯依靠“立刻扩血管”制造疼痛，后面还存在神经系统敏化和偏头痛相关网络被逐步招募的过程。

动物中同样可以看到NTG激活三叉神经节、三叉神经尾侧核等偏头痛相关区域，并产生机械痛敏和畏光。

2、CGRP的位置更靠近已经明确的效应通路

CGRP本身就是三叉神经血管系统中的关键神经肽。

它释放后可以影响三叉感觉传入、脑膜和相关血管结构，并参与感觉敏化。

临床上CGRP输注可以诱发偏头痛样发作，阻断CGRP或其受体又能预防和治疗偏头痛。

所以从转化证据来看，CGRP拥有非常强的靶点有效性。

3、这直接决定两类模型最适合回答的问题

NTG适合问：

在一个由NO触发、随后逐渐招募三叉神经血管系统的偏头痛样环境里，候选药还能不能有效？

CGRP适合问：

当CGRP信号被直接推高以后，候选药有没有能力阻断这条临床已经验证的偏头痛通路？

前一个问题更宽。

后一个问题更集中。

NTG模型能够长期保留下来，有几个非常现实的原因。

1、人体和动物之间存在相对清楚的桥接

NTG在人偏头痛诱发研究中应用非常成熟。

而且患者和健康人对NTG的延迟偏头痛样反应并不完全相同，这给模型增加了一定的疾病易感性背景。

2、动物操作简单

系统给药即可建立模型。

不需要开颅，不需要硬脑膜置管，也不需要复杂电生理操作。

所以它非常适合较大量候选物的早期体内筛选。

3、行为终点比较成熟

小鼠中最常见的是眶周和后足机械痛阈。

根据方案还可以增加畏光、冷刺激敏感以及其他偏头痛相关行为。

4、可以很方便地从急性模型升级成慢性模型

单次NTG适合急性诱发。

经典反复NTG设计通常采用间歇性重复刺激，使动物每次NTG后产生急性痛敏，同时基础机械阈值逐渐下降。

这使同一个诱发物可以同时服务急性治疗药和预防性产品。

5、已有药理参照丰富

舒马曲坦、topiramate、propranolol以及其他已知偏头痛治疗药物，在不同NTG设计中已经积累了大量历史数据。

对于企业建立平台QC很有帮助。

CGRP模型最重要的优势来自它的机制确定性。

1、靶点已经被临床真正验证

很多基础科研靶点在动物里很漂亮，到临床后完全失效。

CGRP没有这个问题。

CGRP受体拮抗剂和CGRP/CGRP受体抗体已经证明这一轴可以真实改变偏头痛患者结局。

所以模型的mechanistic validity非常强。

2、可以形成多个偏头痛相关表型

系统给予CGRP后，小鼠可以出现光回避增加。

还可以表现出面部grimace、眯眼等自发疼痛相关行为。

在不同给药途径和模型背景中，也能够形成机械痛敏。

3、非常适合做药物阻断验证

如果一个候选药声称作用CGRP受体或者下游信号，CGRP挑战可以提供非常直接的药理压力。

药物是否真正覆盖通路，比较容易判断。

4、特别适合CGRP轴生物药开发

对于抗体这类作用时间较长的产品，可以先给予候选抗体，在达到足够系统暴露和靶点覆盖后再进行CGRP挑战。

如果挑战效应被稳定阻断，可以很好地支持target engagement。

但这一层更接近机制药理。

真正疾病药效仍然值得用另一种模型继续验证。

可以用一张表看得更清楚。

如果候选药还处在新靶点PoC阶段，通常希望模型不要和靶点重叠得过于直接。

如果已经进入候选物确认，需要证明明确的target engagement，机制集中的模型反而很有价值。

所以两者经常适合放在不同开发阶段。

假设目前有一个新的偏头痛候选靶点。

它既不是CGRP，也不是NO通路。

第一轮体内模型的任务通常是判断：

干预这个靶点以后，动物偏头痛相关表型会不会真正改善。

这时NTG往往比较方便。

1、模型没有把候选靶点直接作为造模刺激

药效更不容易成为“刺激物和药物刚好互相抵消”的结果。

2、NTG能够同时影响多个相关环节

三叉神经敏化、神经肽信号和感觉过敏都可能参与。

候选药能够在这种复杂背景下保持作用，信息量更高。

3、可以快速做剂量反应

低、中、高剂量候选药加上临床参照，可以较快完成第一轮排序。

4、后续再根据MOA升级模型

如果第一轮发现药物明显影响CGRP释放或受体PD，再进入CGRP挑战。

如果作用硬脑膜感觉神经，可以继续进入局部脑膜模型。

如果作用慢性敏化，可以进入反复NTG。

这样模型会随着产品信息逐渐变得更具体。

如果候选药就是冲着CGRP轴开发，CGRP模型的价值非常高。

例如一个新型小分子：

不直接竞争CGRP受体经典结合位点，但声称能够抑制CGRP受体下游信号。

那么最直接的体内问题就是：

给动物CGRP以后，这个候选药到底能不能把CGRP造成的偏头痛样行为压下来？

如果可以，再结合受体PD和暴露，就能够形成很完整的target engagement。

对于抗体也是类似。

达到稳态抗体暴露以后，再给予外源CGRP挑战。

如果畏光、自发疼痛等表型明显受到抑制，说明药物在体内真正具有足够的CGRP阻断能力。

这类实验非常适合剂量和靶点覆盖关系研究。

例如：

低剂量抗体已经有部分阻断。

中剂量达到明显平台。

继续加量行为改善不再增加。

这时就可以把暴露—target coverage—行为药效逐渐接起来。

这是企业开发中特别需要警惕的一点。

假设造模方式就是给动物外源CGRP。

候选药恰好又是一个强力CGRP中和抗体。

最后模型表型几乎完全消失。

这个结果非常有价值。

它证明候选药能中和CGRP。

但疾病层面的信息仍然有限。

因为实验实际上构建了一个非常纯粹的“CGRP过多”环境。

真实偏头痛患者的发作并不会始终由外源大量CGRP单独驱动。

NO、PACAP、KATP、三叉神经兴奋性、中枢感觉处理以及其他机制都可以参与。

所以候选物确认阶段更建议增加一个病理入口不同的第二模型。

最直接就是NTG。

如果抗CGRP候选药在CGRP挑战里很强，在NTG里同样能够稳定抑制眶周痛敏、畏光或者其他核心终点，数据会明显升级。

这说明药物阻断的CGRP轴确实处于更复杂偏头痛触发过程的关键位置。

模型偏倚并不只发生在CGRP。

如果候选药直接作用：

NO生成。

可溶性鸟苷酸环化酶。

cGMP降解。

NO相关血管或者神经信号。

此时NTG模型本身就和候选药MOA高度重叠。

药效特别强，需要增加额外验证。

一种合理策略是：

第一轮NTG确认候选药确实阻断NO诱发的偏头痛样表型。

第二轮换CGRP或者其他触发机制。

如果换到CGRP后完全没有作用，就说明产品更偏NO触发型偏头痛机制。

如果仍有一定药效，说明干预的位置可能已经进入不同trigger共享的下游通路。

这种结果对临床患者定位也有价值。

模型阴性有时并不意味着项目失败。

它可能在帮助定义药物的作用边界。

急性药最重要的问题是：

发作已经开始以后，药还能不能终止它。

所以给药时间特别重要。

1、模型前预处理更适合药理验证

先给候选药。

达到足够暴露。

随后NTG或CGRP挑战。

如果模型表型被阻断，可以证明药物具备预防trigger作用。

但它和真实急性治疗仍有距离。

2、真正的abortive药需要增加治疗性设计

先给予NTG或CGRP。

让三叉神经敏化和行为表型开始建立。

随后再给候选药。

观察已经发生的痛敏或畏光能不能被逆转。

3、NTG特别适合这一层

NTG诱发以后存在一个逐渐发展的时间过程。

可以围绕候选药未来临床使用场景设计不同延迟时间。

4、CGRP适合验证药物能不能快速阻断已经活跃的神经肽信号

尤其gepant、小分子受体调节剂等起效较快的产品。

因此一个急性药可以分别得到：

预防trigger的能力。

终止已经建立发作表型的能力。

两种数据不能混成一个结论。

预防药和急性药的开发问题完全不同。

患者每天或者长期服药，是为了减少未来发作频率和降低整个系统的发作易感性。

所以模型也需要出现某种持续敏化状态。

反复NTG目前在这方面非常实用。

经典设计中，动物间隔性接受多次NTG。

每次给药以后都会出现急性机械痛敏。

随着刺激重复，两次NTG之间的基础痛阈也逐渐下降。

这说明动物已经从“每次给刺激才痛”进入“整个系统本身变得更敏感”。

对于预防药，这种基础敏化通常比单次NTG后的峰值反应更重要。

如果候选药连续治疗以后：

每次NTG仍然会短暂诱发一定痛敏，但下一次刺激前的baseline不再逐渐恶化，

说明药物可能正在阻止慢性化过程。

这和一次性急性镇痛属于不同产品价值。

可以把两种模型简单拆开。

所以文献里都写“NTG migraine model”，真正的药理意义可能完全不同。

企业项目方案一定要继续看NTG到底给了几次、间隔多久，以及行为测试是在NTG以后还是下一次给药以前完成。

这是慢性偏头痛模型最关键的一个点。

假设每48小时给一次NTG。

动物在每次给药前的眶周阈值已经逐渐从1.0 g降到0.4 g。

给完NTG以后又进一步降到0.1 g。

这里其实存在两个药效窗口。

1、从0.4降到0.1代表本次发作

这是acute hyperalgesia。

急性治疗药可以重点改善这一段。

2、从最初1.0逐渐降到0.4代表慢性化

这是interictal basal sensitization。

预防性候选药更应该阻止这一段继续下降。

3、两个终点可能出现完全不同结果

某个药每次给完都能把急性痛敏压住。

但基础阈值仍然一天比一天低。

它更像强力急性治疗药。

另一个药对每次急性峰值作用一般，却能够长期维持baseline。

它反而可能更接近预防性产品。

所以反复NTG最忌讳最后只统计一个“von Frey结果”。

必须先明确测的是哪一段病程。

CGRP模型也不是一个固定方案。

1、系统给药最适合药物筛选

小鼠腹腔给予CGRP后，可以形成比较成熟的畏光和自发疼痛样表型。

操作方便、批量能力较强。

一些经典体系中常见0.1 mg/kg左右的外周CGRP挑战，但真正项目仍应根据品系、肽来源和目标终点重新摸索。

2、硬脑膜或硬脑膜上方局部给药更靠近三叉神经脑膜末梢

这种方案能够减少部分全身作用，让模型更加集中于脑膜—三叉神经轴。

特别适合研究外周感觉末梢、脑膜免疫或者局部CGRP信号。

3、技术难度随之增加

手术操作、局部组织刺激和动物恢复都会引入额外变量。

4、局部CGRP还存在明显性别效应

部分硬脑膜/脑膜上方CGRP研究中，雌性动物对低剂量CGRP更加敏感。

所以这一模型如果用于正式候选物确认，性别不能作为普通背景变量处理。

CGRP生物学具有明显的模型依赖性。

1、不同小鼠品系对CGRP的行为敏感度不同

以畏光模型为例，CD1和C57BL/6J都可以出现CGRP诱导的light aversion，但CD1往往反应更稳定、幅度更明显。

如果直接把一个品系的刺激条件复制到另一个品系，很可能出现模型组差异不足。

2、性别效应尤其值得关注

偏头痛临床本身就具有明显女性高发特征。

动物研究中，部分CGRP相关疼痛和脑膜敏化也呈现明显雌性偏向。

3、慢性化还会改变这种敏感度

很有意思的是，反复NTG造成慢性敏化以后，原本对低剂量CGRP反应较弱的动物也可能变得更加敏感。

这说明CGRP susceptibility本身可能随着疾病状态改变。

4、因此CGRP剂量不能脱离疾病背景解释

同样剂量在naïve动物里没有表型，在慢性偏头痛背景里可能已经足以诱发明显反应。

这反而提供了一个很好的第二模型思路：

先让动物慢性化，再用亚阈值CGRP挑战。

观察候选药能否降低整个三叉神经系统的CGRP易感性。

眶周机械痛敏是偏头痛动物模型非常实用的终点。

因为它位于三叉神经支配区域。

1、特别适合评价头面部allodynia

临床偏头痛患者在发作期间经常出现头皮或面部触碰疼痛。

所以眶周机械阈值具有一定转化意义。

2、可以重复测量

很适合急性时间曲线和慢性纵向研究。

3、测试人员影响比较大

动物固定方式、von Frey施加位置、刺激角度和判定标准都会影响结果。

4、过度抓持会增加应激

长期项目尤其需要提前进行习惯化。

5、它仍然属于诱发性疼痛

研究人员主动拿纤维去刺激动物。

而临床偏头痛最主要的问题是没有人碰头也会痛。

所以正式候选物确认最好再增加至少一个非诱发或伴随症状终点。

NTG模型中经常同时测眶周和后足机械阈值。

两者信息并不一样。

1、眶周更接近头面部三叉感觉敏化

与偏头痛头痛区域的联系更直接。

2、后足痛敏反映更广泛的感觉系统敏化

偏头痛严重或慢性化以后，部分患者会出现头部之外的皮肤异常敏感。

这种表型与更高级中央感觉处理有关。

3、两个终点同时改善，说明药物作用范围更广

可能同时影响三叉神经和中央敏化。

4、只改善眶周也完全可能符合MOA

一个高度外周三叉神经靶向产品，本来就不一定明显改变后足痛阈。

所以不能因为后足没有显著，就直接把眶周药效判定为“不够完整”。

终点解释必须回到产品定位。

Photophobia是偏头痛非常典型的临床伴随症状。

因此light aversion能够给机械痛阈增加一个完全不同的行为维度。

CGRP模型尤其适合做这一终点。

1、测试前需要充分习惯化

小鼠天然会偏好暗环境。

如果第一次进light-dark box就直接测试，探索行为会严重影响结果。

2、光照强度必须预实验

不同品系对光的基础敏感度不同。

光太弱，模型差异出不来。

光太强，正常组也全部躲进暗区，就会形成ceiling effect。

3、必须同步记录运动

CGRP或候选药可能改变动物休息时间和活动。

如果动物因为镇静长期躺在暗箱里，看起来就会非常“畏光”。

4、真正有价值的是光环境特异性行为改变

在光区减少活动，但总体运动并没有被严重抑制，解释会更加清楚。

对于主打感觉过敏改善的新型偏头痛药，畏光完全可以在候选物确认阶段提高权重。

偏头痛的核心仍然是自发头痛。

所以如果动物实验完全依赖von Frey，其实一直在测“被碰以后痛不痛”。

CGRP模型的一个优势，是可以利用面部grimace、orbital tightening或者视频化眯眼分析补充非诱发疼痛。

1、动物不需要额外机械刺激

更接近自发不适状态。

2、可以和畏光分开解释

CGRP诱导的面部疼痛样表情在黑暗环境中也可以存在。

说明这个终点并非单纯来自光刺激。

3、适合急性药物

候选药能否快速减少自发疼痛样行为，是很有价值的abortive readout。

4、仍然要注意镇静

动物非常困倦时，眼裂和面部状态同样可能改变。

所以视频分析最好和自主活动共同解释。

偏头痛行为并不适合“指标越多越好”。

可以根据产品定位建立分层。

正式项目最好提前确定一个primary behavioral endpoint。

另外一到两个终点用于收敛验证。

如果测了八个行为，最后只有一个显著，产品价值需要谨慎解释。

偏头痛候选药大量作用中枢、神经肽和血管。

行为混杂尤其多。

1、镇静可以影响几乎所有终点

动物不愿意活动，可能导致light-dark结果变化，也可能改变grimace和刺激反应。

2、强运动兴奋也可能改变von Frey

动物持续躁动，撤足反应和测试重复性都会下降。

3、NTG和CGRP本身还具有外周血管作用

动物的一般状态、血压和活动可能随之变化。

4、建议保留基础活动控制

开放场总移动距离。

light-dark中的运动。

一般状态。

必要时增加血压等生理评价。

5、行为改善最好不要和明显运动改变同步出现

例如候选药让眶周痛阈恢复，同时自主活动维持正常。

这类结果比“动物突然变得特别兴奋，同时Frey阈值升高”更加可信。

偏头痛模型没有一个适合全部产品的固定阳性药。

1、舒马曲坦适合验证经典急性抗偏头痛响应

特别适合急性NTG和部分CGRP相关行为。

它具有较成熟历史药理数据。

2、gepant更适合CGRP受体方向

如果候选药准备和CGRP小分子药物竞争，使用gepant作为参考能够直接比较同一临床靶轴。

3、抗CGRP抗体适合长期或预防性产品

抗体PK长，给药时间和小分子完全不同。

通常需要提前达到足够暴露，再做challenge。

4、阳性药需要和问题匹配

如果实验核心想验证“这个CGRP模型能不能被CGRP通路阻断”，gepant或抗CGRP药非常合适。

如果想证明模型对传统急性治疗也有药理预测性，可以增加triptan。

有时两种参照共同存在，比固定一个舒马曲坦更有信息。

生物药项目中，这一步比NTG还是CGRP更靠前。

1、人源抗体可能不识别鼠CGRP或鼠CGRP受体

如果完全没有结合，普通小鼠模型没有真正药理意义。

2、亲和力明显下降同样会影响结果

体外能够“测到结合”，并不代表动物需要的暴露和人体一致。

3、可以采用不同解决策略

使用针对鼠靶点的surrogate antibody。

使用靶点人源化动物。

或者选择候选抗体真正具有药理活性的其他物种。

4、模型和分子要同时匹配

即使CGRP模型本身非常成熟，只要候选抗体没有真正target engagement，行为阴性就不能解释成药物靶点失败。

这一点应该在正式动物药效之前解决。

偏头痛实验很容易固定成：

候选药给完30分钟。

随后NTG或CGRP。

这只是一个操作习惯，并不适合所有候选物。

1、口服小分子要看Tmax

候选药两小时以后脑或三叉神经节暴露才达到高水平，30分钟挑战很容易把真正有效药做成弱阳性甚至阴性。

2、外周靶点药需要看外周target engagement

某些CGRP抗体几乎不需要大量进入脑组织，也能产生临床作用。

此时血浆和外周靶点覆盖比脑浓度更加重要。

3、中枢候选药则需要脑暴露

尤其作用TNC、丘脑、PAG或者其他中枢网络的产品。

4、急性治疗模型还要区分“挑战前暴露”和“发作后治疗”

如果药物只在挑战前有效，说明更偏预防trigger。

挑战后仍然能够逆转表型，才更接近临床abortive能力。

所以PK/PD决定的不只是剂量。

它还决定实验应该在什么时候挑战、什么时候测行为。

1、NTG首先要控制制剂和vehicle

实验用NTG常来自含有特定溶剂的制剂。

不同浓度稀释以后，对照组必须保持相同vehicle背景。

2、NTG需要固定给药时间和行为窗口

NTG效应具有明显时间过程。

一组在1小时测，一组在3小时测，结果很难直接比较。

3、反复NTG需要固定刺激间隔

慢性化本身依赖重复刺激节律。

中途因为周末或者操作方便改变间隔，可能改变基础敏化。

4、CGRP要控制肽的制备和保存

多肽对配制、冻融和保存条件更加敏感。

长期批次实验最好减少反复冻融。

5、CGRP需要固定品系

不同品系模型强度不同。

中途更换动物来源或遗传背景以后应重新验证剂量。

6、性别需要提前确定

尤其局部脑膜CGRP模型。

如果两性都做，建议预先考虑sex × treatment分析，而不只是把雌雄简单混合。

7、所有行为都需要充分习惯化和盲法

眶周von Frey尤其依赖操作者。

light-dark box又受到环境和探索行为影响。

这些技术变异完全可能大于中等程度的真实药效。

这张表最终可以压缩成一个开发原则：

想知道药物能不能挡住CGRP，CGRP模型最直接。

想知道药物能不能挡住一个更复杂的偏头痛触发过程，NTG提供的信息通常更多。

第二模型应该主动改变病理入口。

1、第一轮NTG阳性

如果机制提示CGRP参与，可以进入CGRP模型。

看候选药能否直接阻断CGRP诱导行为。

2、第一轮CGRP阳性

优先考虑NTG。

这是CGRP靶向产品尤其重要的一步。

离开外源CGRP以后仍然有效，证据明显更强。

3、如果候选药准备做慢性预防

急性模型阳性后进入反复NTG。

重点看发作间期基础敏化。

4、如果产品准备覆盖CGRP低响应患者

CGRP模型继续加码的意义会逐渐下降。

可以进入PACAP等另一条神经肽通路。

5、如果产品做先兆偏头痛

后续应考虑CSD。

因为NTG和CGRP无法完整替代皮层扩散性去极化。

6、如果产品作用脑膜三叉感觉末梢

可以增加硬脑膜局部刺激。

这样能把系统性诱发模型和局部三叉神经机制拆开。

所以第二模型真正需要做的，是挑战第一模型最容易让候选药成功的地方。

1、所有候选药固定单次NTG

急性药和预防药没有区分。

2、抗CGRP药只做外源CGRP模型

模型和靶点高度匹配。

3、NO通路药只做NTG

同样存在机制富集。

4、看到NTG后von Frey下降就定义“偏头痛造模成功”

只验证了一个感觉维度。

5、只测后足，不测眶周

失去头面部三叉区域信息。

6、只测眶周，又把结果直接等同于完整偏头痛发作

证据边界过宽。

7、急性治疗药全部在trigger前给

只能证明预防性阻断。

8、预防药只看单次challenge

没有慢性化背景。

9、反复NTG只看每次注射后的急性痛阈

没有分析baseline sensitization。

10、baseline已经下降以后仍然只比较绝对值

需要同时考虑相对本轮挑战前的变化。

11、CGRP剂量直接从其他品系照搬

模型动态范围可能完全不同。

12、光照越强越好

正常动物也全部进入暗区，形成ceiling effect。

13、light aversion不记录运动

无法排除镇静。

14、grimace不控制一般状态

面部改变可能混入全身不适。

15、中枢候选药不做自主活动

兴奋或镇静会污染多个行为。

16、CGRP抗体没有确认鼠源交叉反应

模型失去target engagement。

17、只根据mg/kg比较小分子和抗体

两种产品的PK和给药节律完全不同。

18、所有口服药固定30分钟后挑战

没有依据动物PK。

19、只测血浆暴露

中枢产品缺少脑或目标组织信息。

20、CGRP抗体必须要求高脑暴露

外周作用本身可能已经足够产生临床药效。

21、只有一个行为终点显著就直接Go

缺少独立症状维度的支持。

22、同时做大量行为，最后挑最显著的一项

增加假阳性风险。

23、模型组做得越敏感越好

过强challenge会形成ceiling effect。

24、长期只使用雄性动物

忽略偏头痛明显的性别差异。

25、雌雄简单合并统计

可能把真实性别效应稀释掉。

26、第二模型继续换一个NTG剂量

新增开发信息很有限。

1、先明确产品是急性药还是预防药

这是整个方案最前面的决策。

急性药强调终止已经发生的发作。

预防药强调降低长期发作易感性和慢性敏化。

2、再明确候选药距离CGRP轴有多近

直接中和CGRP。

阻断受体。

抑制CGRP释放。

作用更上游三叉神经。

或者完全属于新靶点。

距离越近，CGRP模型越适合做target engagement，但也越需要正交模型。

3、早期PoC选择一个具有合理动态范围的模型

新靶点可以优先NTG。

CGRP轴候选物可以先通过CGRP challenge快速确认通路有效性。

4、建立本平台自己的刺激—反应条件

不要直接复制文献剂量。

NTG和CGRP都应该在当前动物品系、性别和终点下进行小规模预实验。

找到既能稳定成模，又没有ceiling effect的刺激强度。

5、正式实验前固定主要行为终点

例如急性NTG项目以眶周机械阈值为主要终点。

CGRP感觉过敏项目可以将light aversion或自发疼痛提高权重。

其他行为辅助验证。

6、提前做行为习惯化

von Frey习惯抓持。

light-dark提前预暴露。

grimace固定拍摄环境。

把动物对实验本身的应激降下来。

7、先确认候选药不会明显镇静或兴奋

必要时独立做活动评价。

尤其快速中枢药。

8、按照PK确定候选药给药时间

口服药根据Tmax。

抗体根据target coverage。

中枢药关注脑暴露。

外周CGRP产品则优先保证外周靶点覆盖。

9、急性治疗药增加“发作后给药”

先trigger。

后治疗。

观察能否逆转已经建立的行为异常。

这一步比challenge前预处理更接近真实临床。

10、预防药进入反复NTG

连续治疗过程中分别记录：

每次NTG前的baseline。

NTG后的急性变化。

这样才能把慢性化和单次发作拆开。

11、建立近端PD

CGRP轴药物看对应受体或CGRP相关信号。

新靶点则根据真实MOA选择三叉神经节、TNC、脑膜或其他相关组织。

减少只测c-Fos这一类泛激活指标。

12、行为和PD必须在时间上对应

如果行为2小时最明显，PD却只在24小时检测，二者很难形成真正的机制链。

13、第一模型阳性以后主动换病理入口

NTG换CGRP。

CGRP换NTG。

慢性产品再加入repeated NTG。

先兆产品进入CSD。

CGRP低响应患者定位可以进一步进入PACAP。

14、候选物确认阶段增加性别信息

特别是CGRP相关候选药和慢性偏头痛。

可以先在成熟体系完成基础PoC，再增加雌性或双性别验证。

15、生物药进入正式药效前解决物种问题

确认结合。

确认功能阻断。

确认动物PK。

随后再决定使用普通动物、surrogate molecule还是人源化体系。

16、最终把剂量转成有效暴露

企业最后真正需要的结果不应停留在：

3 mg/kg有效。

10 mg/kg更有效。

更有价值的是明确：

达到什么血浆、脑或外周目标组织暴露以后，靶点开始被充分覆盖；行为药效何时出现；继续提高暴露以后有没有平台；药效能够维持多久。

17、最终形成Go/No-Go证据链

比较扎实的偏头痛候选药数据应该能够说明：

候选药在临床可实现的给药时间和暴露条件下命中目标，并改善与产品定位一致的偏头痛相关行为。离开第一套与自身MOA最匹配的模型以后，在另一种偏头痛触发背景下关键药效仍然成立。对于预防性产品，还能够降低反复刺激形成的基础敏化；对于急性药，则能够在发作样表型已经建立以后产生治疗作用。

到了这一层，NTG和CGRP就不再是两个互相竞争的模型。

它们开始分别承担筛选、机制确认和转化验证中的不同任务。

1、可以根据候选药临床定位选择NTG或CGRP模型

结合产品属于急性治疗、预防治疗、CGRP轴、三叉神经、新型中枢靶点还是感觉过敏方向，确定第一模型应该更强调复杂偏头痛trigger还是直接靶点挑战。

2、可以建立单次NTG急性偏头痛样模型

根据项目优化NTG剂量、给药方式和行为窗口。

用于早期候选物筛选和急性药效PoC。

3、可以建立反复NTG慢性偏头痛样模型

连续记录每次刺激后的急性痛敏和发作间期基础敏化。

根据产品区分急性镇痛和预防慢性化作用。

4、可以建立CGRP诱导模型

根据项目选择系统性CGRP挑战或更靠近三叉神经脑膜轴的局部刺激方式。

用于CGRP相关target engagement和机制确认。

5、可以开展眶周和后足机械痛敏评价

将头面部三叉感觉敏化与广泛中央敏化分开分析。

避免不同区域痛阈直接合并解释。

6、可以增加畏光评价

根据动物品系优化光照条件并进行充分习惯化。

同步记录活动，排除镇静造成的假性light aversion变化。

7、可以开展自发疼痛相关行为

根据项目增加面部表情、眯眼等非诱发性疼痛评价。

与von Frey形成互相独立的行为证据。

8、可以进行候选药自主活动和一般状态控制

针对中枢药物排除镇静、兴奋和运动异常对偏头痛行为的影响。

9、可以根据候选药重新选择阳性药

急性模型可使用临床急性治疗参照。

CGRP轴项目可以增加gepant或相应CGRP通路药理参照。

预防药则根据产品定位选择更合适的预防性阳性药。

10、可以根据动物PK调整challenge时间

通过血浆和必要的脑/目标组织暴露，确定候选药什么时候达到有效浓度。

避免所有化合物机械采用固定“给药30分钟后造模”。

11、可以建立偏头痛相关PK/PD

针对三叉神经节、TNC、脑膜或其他相关组织，根据候选药MOA选择近端PD。

将剂量、暴露、靶点和行为药效连接起来。

12、可以为急性候选药建立治疗性给药方案

在NTG或CGRP challenge以后再给予候选药。

判断已经形成的偏头痛样行为能否被逆转。

13、可以为预防性候选药评价药效持续性

观察反复刺激过程中基础敏化是否减轻，以及停药以后易感状态是否快速恢复。

14、可以根据生物药属性处理物种匹配

确认候选抗体与动物靶点的结合和功能活性。

需要时使用surrogate molecule或合适的人源化体系。

15、可以根据第一模型结果设计第二模型

NTG阳性以后进入CGRP，判断CGRP轴是否属于关键机制。

CGRP阳性以后进入NTG，排除外源靶点刺激造成的模型过度匹配。

慢性、先兆或CGRP低响应产品再根据临床定位继续升级。

偏头痛模型选NTG还是CGRP，真正需要避免的是把它理解成“传统模型和新模型”的替换关系。

NTG的价值在于，它给候选药提供了一个更宽的偏头痛触发背景。

NO信号启动以后，三叉神经血管系统、CGRP以及多个感觉处理环节会逐渐参与其中。一个新靶点药能够在这种环境里保持药效，通常比只在自己的靶点被直接外源刺激时阳性提供更多疾病信息。

CGRP的优势则来自它已经被临床充分验证。

如果一个候选药声称作用CGRP轴，却连外源CGRP挑战都无法稳定阻断，就需要优先反查药物暴露、target engagement和MOA。

所以真正成熟的开发策略往往会让两种模型分工。

CGRP模型帮助回答候选药有没有真正把CGRP这条通路压住。

NTG继续回答，当疾病从一个更上游、更复杂的trigger启动以后，这种靶点作用还能不能转化成偏头痛相关行为改善。

对于慢性预防药，再继续把单次NTG升级到反复NTG，观察整个感觉系统有没有从长期敏化状态中恢复。

对于急性药，则把给药时间移到trigger之后，证明药物面对已经建立的发作样状态仍然能够工作。

做到这一层以后，NTG和CGRP提供的就不再是两套重复的“von Frey结果”。

它们会共同回答几个真正影响候选药开发的问题：

这个药到底作用于偏头痛病理的哪一层，在什么时间给最有效，面对不同trigger还能不能保持药效，以及第一套最容易让它成功的模型被拿掉以后，这个候选药还能不能继续成立。