EGFR突变NSCLC候选药进入奥希替尼耐药阶段以后，动物模型很容易出现一个选择问题：到底直接构建EGFR C797S耐药模型，还是先用奥希替尼长期筛选PC9、H1975等细胞，让它们自己形成耐药，再建立CDX？

两种方案都可以得到“奥希替尼不敏感”的肿瘤，但它们模拟的耐药完全不同。

C797S是典型的EGFR靶内耐药。奥希替尼依赖与EGFR Cys797形成共价结合，C797S突变使这一结合方式受到破坏。因此，如果候选药是一款明确针对C797S的第四代EGFR-TKI，使用基因编辑获得的Ex19del/C797S、L858R/C797S或者L858R/T790M/C797S模型，可以非常直接地验证候选药有没有真正克服目标突变。

长期药物诱导则更接近另一类临床问题。

肿瘤在持续奥希替尼压力下存活，最终获得耐药时，可能出现EGFR二次改变，也可能通过MET等旁路信号重新激活下游，还可能进入EMT样状态、改变细胞谱系和代谢依赖。换句话说，这类模型保留了“肿瘤怎样在药物选择压力下找到活路”的过程，但耐药机制也会因此更加复杂。

这决定了两种模型最适合的产品不同。

一款专门解决C797S的第四代EGFR抑制剂，第一模型应该尽量干净；一款准备覆盖更广泛奥希替尼获得性耐药，或者与EGFR抑制剂联合延缓耐药的候选药，则需要更复杂的长期诱导模型。

真正成熟的开发路线，通常也不会让其中一个模型包办全部结论。更合理的思路是先回答药物能不能解决设计时瞄准的耐药机制，再让它进入更复杂的获得性耐药环境，看看产品离开最有利的模型以后还能不能保持作用。

奥希替尼耐药首先需要区分靶内耐药和靶外耐药。

靶内耐药仍然围绕EGFR本身发生。C797S是其中最典型的一类，同时还可以出现其他影响药物结合或激酶结构的EGFR改变。

靶外耐药则复杂得多。肿瘤可以通过MET等旁路RTK重新激活RAS-MAPK或PI3K-AKT信号，也可能发生下游通路改变、融合事件以及组织学或细胞状态转换。

这两类耐药对新药提出的要求不同。

如果候选药结构设计的核心目标就是绕开C797S以后奥希替尼无法有效共价结合的问题，它需要的是一个明确依赖C797S的模型。

如果候选药是一种EGFR联合药、旁路抑制剂或者广谱耐药组合，只使用C797S会把临床耐药问题缩得太窄。

所以“奥希替尼耐药”应该先拆成具体机制，再决定动物模型。

直接C797S模型最大的优势，是因果非常清楚。

以H1975为例，原始细胞具有EGFR L858R/T790M。进一步通过基因编辑加入C797S，就可以形成L858R/T790M/C797S三突变背景。

此时如果原始H1975对奥希替尼敏感，而三突变细胞明显耐药，候选第四代EGFR抑制剂又能够重新抑制细胞增殖和EGFR信号，体内CDX中进一步恢复退瘤，就形成了非常直接的药理证据。

候选药解决的并不是一个模糊的“耐药状态”，而是一个明确的靶点结构变化。

这类模型特别适合比较不同第四代EGFR抑制剂的酶活、细胞活性、野生型EGFR选择性、体内PK/PD和退瘤深度。

早期候选物较多时，这种模型效率也明显高于每个化合物都先进入复杂的长期诱导耐药体系。

长期诱导模型的价值来自选择过程。

可以从PC9、H1975等奥希替尼敏感或相对敏感细胞开始，通过持续或者逐渐增加奥希替尼浓度，使大部分细胞死亡，只留下能够在药物压力下存活并重新增殖的细胞。

经过数周甚至更长时间以后，最终获得稳定耐药株。

这些细胞的意义在于，它们的耐药方式没有被实验人员提前规定。

一部分模型可能出现EGFR相关改变，另一部分可能通过MET、ERBB家族或其他旁路信号重新获得增殖能力，也可能形成EMT样状态、慢增殖耐受状态或者多个机制共存。

因此长期诱导更适合回答一个复杂问题：

候选药面对经过奥希替尼长期选择之后的肿瘤，还能不能工作。

代价也非常明确。

这种模型的机制没有C797S模型那么干净，如果不做完整表征，很容易变成“我们有一株耐药细胞，但并不知道它为什么耐药”。

PC9和H1975虽然都属于EGFR突变NSCLC经典细胞，但基础遗传背景不同。

PC9通常以EGFR Ex19del为主要驱动，对EGFR依赖较强，适合研究经典敏感型EGFR突变在持续药物压力下如何获得耐药。

H1975则带有L858R/T790M，本身就包含一个经过早期EGFR-TKI治疗时代非常重要的耐药突变背景，对研究T790M基础上的C797S三突变尤其方便。

因此第四代EGFR-TKI如果明确针对L858R/T790M/C797S，H1975编辑模型非常直观。

如果产品未来希望覆盖一线奥希替尼治疗后出现的C797S，则还应该考虑没有T790M的Ex19del/C797S或L858R/C797S背景。

这点非常重要，因为今天奥希替尼已经大量前移到一线治疗，临床耐药时并不一定存在T790M。

所以一个候选药不能因为在H1975三突变模型中效果很好，就默认覆盖全部临床C797S患者。

“有C797S”仍然不够精确。

首先需要知道基础EGFR激活突变是什么，是Ex19del还是L858R。

其次需要确认是否同时存在T790M。

对于同时存在T790M和C797S的情况，还需要关注两种突变位于同一等位基因还是不同等位基因，也就是常说的cis和trans关系。

这一信息会影响部分EGFR抑制剂组合的药理解释。

所以直接构建模型时，最好从候选药未来真正计划覆盖的分子亚型倒推模型。

如果新药结构设计的核心就是解决三突变EGFR，三突变模型可以作为第一模型。

如果产品准备覆盖一线奥希替尼后的广泛C797S人群，则需要增加不同activating mutation和T790M状态的模型。

模型越精准，候选药的临床人群边界也越容易在动物阶段提前看清。

长期奥希替尼诱导完成以后，第一步不应该马上去种皮下瘤。

需要先回答：

这株细胞究竟是怎么耐药的？

至少需要确认奥希替尼IC50发生了多少变化，耐药在撤药培养后能否保持，以及EGFR和下游信号对奥希替尼的抑制是否发生改变。

随后根据项目需要进一步检查EGFR二次突变、MET及其他旁路信号，以及与细胞状态转换相关的变化。

如果发现奥希替尼已经不能抑制p-EGFR，同时存在C797S，模型更偏on-target resistance。

如果p-EGFR仍然能够被压制，但p-ERK或p-AKT通过其他RTK迅速恢复，则更接近旁路耐药。

如果细胞形态、上皮和间质标志发生大幅变化，则还需要考虑状态转换。

只有完成这一层，后面的动物药效才知道在验证什么。

否则候选药阳性以后很难判断它真正克服了哪一种耐药。

长期诱导耐药也可以再拆成两种方案。

第一种是在体外先获得稳定耐药株，再把耐药细胞接种到小鼠。

它的优势是效率高、起始状态统一，所有动物从Day 1开始就是耐药肿瘤，非常适合下一代候选药筛选。

第二种是在小鼠中先建立奥希替尼敏感肿瘤，持续给予奥希替尼，使肿瘤经历退缩、残留和最终再生长，再从真正进展的肿瘤中分析耐药机制或者直接进行后续治疗。

第二种周期更长，动物消耗也更大，但它保留了一个重要过程：药物选择发生在完整肿瘤环境中。

如果项目研究“耐药以后用什么药”，预制耐药CDX非常高效。

如果研究“怎样阻止耐药形成”或者“为什么残留细胞最终重新长起来”，体内持续给药模型的信息更多。

两者也不应该混用同一种结论。

如果产品的结构设计非常明确，目标就是C797S，第一模型建议优先选择定义清楚的C797S模型。

开发初期最需要证明的是几个问题：

候选药是否真正抑制C797S EGFR，能否避开奥希替尼的结合障碍，是否保持对EGFR WT的选择性，以及体内有效暴露能否持续压制p-EGFR和下游信号。

这种阶段如果直接进入一个机制复杂的长期诱导耐药株，一旦药物效果一般，很难判断是分子本身没有打中C797S，还是模型实际上依赖MET或其他旁路。

所以第一模型应该尽量帮助药化和药理团队回答最核心的结构设计问题。

当C797S这一关通过以后，再把候选药放进长期诱导耐药模型，挑战其药效边界。

这个顺序更适合第四代EGFR-TKI。

有些产品开发定位并不是单纯第四代EGFR抑制剂。

例如候选组合希望克服多种奥希替尼耐药，或者通过抑制旁路信号延缓复发。

这种情况下，C797S模型只能回答其中一个耐药分支。

如果候选药在三突变CDX里退瘤非常漂亮，只能说明它对这个定义明确的靶内耐药有效。

真正面对MET等旁路激活、细胞状态变化或者多个耐药机制共存时，结果可能完全不同。

因此广谱耐药产品应该较早加入至少一种长期诱导耐药体系。

如果产品明确针对MET bypass，则应进一步使用已经确认MET驱动的奥希替尼耐药模型，而不是让一个随机诱导出来的耐药株承担全部验证。

“复杂耐药”也需要分层。

复杂不等于机制不清。

奥希替尼耐药模型中，短期TGI很重要，但已经不够。

一款候选药可以让肿瘤在14天内停止增长，却没有真正造成肿瘤回缩。

另一款可以快速产生深度退瘤。

对于EGFR驱动肿瘤，这两种药效的开发意义不同。

因此建议同时关注肿瘤生长抑制、肿瘤回缩深度以及达到CR或PR样状态的比例。

如果模型本身对奥希替尼高度耐药，还要设置奥希替尼对照确认耐药表型在体内成立。

一套非常常见但容易遗漏的问题是：体外耐药株种进小鼠以后，因为没有持续奥希替尼选择压力，耐药程度发生变化。

所以建立CDX后需要重新验证。

体外IC50提高，并不能自动替代体内耐药证明。

对于下一代EGFR药物和联合方案，越来越值得关注的是durability。

两个方案都可以把肿瘤压到几乎测不到。

如果停止治疗以后，一个模型7天就开始重新增长，另一个维持数周不复发，两者对残留病灶的影响显然不同。

这种设计特别适合研究drug-tolerant persister。

一些候选组合的主要价值可能不是让最大退瘤幅度再提高10%，而是减少那些在强EGFR抑制下仍然存活的细胞。

所以核心候选物可以增加停药观察。

还可以在最大缓解时取一部分残留瘤，分析p-EGFR、p-ERK、Ki67、凋亡以及耐受相关状态。

短期TGI告诉我们药物能不能压住肿瘤。

停药复发则进一步告诉我们压住以后还留下了多少可以重新启动疾病的细胞。

第四代EGFR-TKI最核心的体内证据之一，是肿瘤暴露和target engagement。

单纯看到20 mg/kg有效还不够。

需要知道这个剂量产生了多少血浆和肿瘤暴露，在什么暴露水平下能够持续抑制突变EGFR，并进一步压制p-ERK、p-AKT等下游信号。

最好增加不同给药后时间点。

例如给药后2小时p-EGFR几乎完全下降，12小时已经明显恢复，这种PD持续时间会直接影响QD还是BID给药设计。

如果候选药具有很好的肿瘤滞留，即使血浆浓度下降以后肿瘤内PD仍然维持，也可能形成产品优势。

另外还要关注EGFR WT相关安全窗口。

C797S候选药最终需要的不只是强效。

还需要在突变EGFR有效暴露和野生型EGFR相关毒性之间保留足够选择性。

EGFR突变NSCLC脑转移非常常见，奥希替尼本身已经具有较好的CNS活性。

所以后续第四代EGFR候选药如果希望真正替代或者接续奥希替尼，仅仅在皮下C797S CDX中取得很好TGI，仍然缺少一个重要产品属性：脑穿透。

这类产品可以在皮下模型先完成基本抗肿瘤PK/PD，再进一步确认脑/血浆暴露和脑内有效浓度。

进入后期后，还可以建立C797S颅内模型验证intracranial efficacy。

如果候选药皮下退瘤很强，却因为P-gp/BCRP外排导致脑暴露极低，它对临床EGFR耐药患者的竞争力会明显受到限制。

所以对于明确标注brain-penetrant的第四代EGFR-TKI，CNS PK最好尽早进入候选物筛选，而不是最后再补。

第二模型真正需要做的，是主动离开第一模型最有利的条件。

如果一款专门针对C797S设计的药只在一个C797S细胞系中阳性，证明的是设计基本成立。

进入另一EGFR背景和复杂获得性耐药模型以后仍然有效，产品边界才开始清楚。

1、把所有奥希替尼耐药统一称为“C797S耐药”，没有先确认真实机制。

2、第四代EGFR候选药只做H1975 L858R/T790M/C797S，就直接外推全部一线奥希替尼后C797S患者。

3、没有区分Ex19del和L858R背景，也没有考虑T790M是否存在。

4、三突变模型中没有明确C797S与T790M的等位关系，却直接讨论特定EGFR组合治疗策略。

5、长期诱导获得耐药株后，只测一次奥希替尼IC50，没有进一步分析EGFR和旁路机制。

6、耐药株持续撤药培养很长时间，没有重新确认耐药表型是否稳定。

7、体外耐药细胞直接种成CDX，没有验证体内对奥希替尼是否仍然耐药。

8、长期药物诱导得到一个复杂耐药株，却因为发现某个蛋白升高就直接将其定义为唯一耐药机制。

9、C797S模型中候选药有效以后，继续在同一个细胞系增加剂量，没有更换EGFR背景。

10、广谱奥希替尼耐药产品只使用C797S模型，没有旁路或诱导耐药模型。

11、候选药准备解决MET介导耐药，却使用机制未知的随机耐药株作为核心模型。

12、只比较终点TGI，没有确认p-EGFR和下游信号是否真正被持续抑制。

13、奥希替尼耐药模型没有设置奥希替尼对照，无法证明当前体内模型确实耐药。

14、两个候选药都接近CR以后，仍然只比较Day 21肿瘤体积，没有增加停药复发。

15、联合方案从肿瘤接种当天开始治疗，最后直接声称能够克服获得性耐药。

16、研究“延缓耐药”却直接使用已经完全耐药的细胞，模型无法回答耐药形成过程。

17、研究“耐药后治疗”却只使用敏感瘤同步联合给药，临床场景发生错位。

18、第四代EGFR药皮下模型药效很好，却没有在候选物收敛阶段评估脑穿透。

19、只做健康动物PK，没有建立肿瘤组织暴露和p-EGFR抑制关系。

20、第一模型阳性以后第二轮仍然只做另一剂量，没有真正改变耐药机制。

1、先定义产品准备解决哪一种奥希替尼耐药

第四代EGFR-TKI首先明确是否针对C797S以及具体突变组合。

旁路抑制剂明确是否针对MET或其他已知驱动。

广谱耐药组合则需要提前接受多机制模型验证。

2、早期使用定义清楚的耐药模型完成靶点PoC

C797S药物优先使用经过基因确认的C797S细胞，先完成酶活、细胞增殖和EGFR信号验证。

避免一开始就让复杂诱导耐药掩盖分子本身的真实活性。

3、建立对应CDX并重新确认奥希替尼耐药

正式给候选药前，先确认奥希替尼在这一模型中的TGI明显下降或无法造成预期退瘤。

模型耐药成立以后，后续比较才有意义。

4、建立肿瘤PK/PD

通过不同剂量和时间点连接血浆暴露、肿瘤浓度、p-EGFR、p-ERK/p-AKT和肿瘤响应。

确定最低有效暴露和PD持续时间。

5、加入不同EGFR遗传背景

候选药如果准备覆盖更广泛C797S患者，需要从单一三突变进一步进入Ex19del、L858R以及不同T790M状态。

模型应跟随临床人群扩展。

6、核心候选物进入长期诱导耐药模型

先对耐药株做明确分子分型，再评价候选药。

如果药物只在纯C797S有效、复杂诱导耐药无效，产品可以明确定位为C797S精准治疗，而无需强行包装成广谱耐药药物。

7、针对旁路耐药使用定义模型

发现MET驱动以后，可以进一步通过MET相关干预确认因果，再进入候选组合。

不要长期依赖机制未知的“耐药株”。

8、根据临床方案区分前线联合和耐药后治疗

准备预防耐药的组合，从敏感肿瘤开始长期用药，观察time to progression。

准备治疗已形成耐药的产品，则从稳定耐药肿瘤开始治疗。

两类实验不要混成一套。

9、增加停药后的复发观察

对于取得深度退瘤的方案，比较停药后的tumor regrowth。

进一步判断产品是否真正减少残留耐药种子。

10、根据需要分析残余肿瘤

在最深缓解阶段或复发阶段取材，检测EGFR、旁路信号和细胞状态。

观察候选药治疗以后是否重新选择出新的耐药亚群。

11、脑转移定位产品增加CNS PK和颅内药效

皮下模型完成候选物筛选后，进一步确认脑暴露及C797S颅内模型药效。

避免一个外周强效但无法进入脑的分子进入过晚阶段才暴露问题。

12、最终形成Go/No-Go证据链

对于第四代EGFR-TKI，理想证据应该做到：在定义明确的C797S背景中能够产生稳定退瘤，肿瘤暴露和EGFR target engagement对应，离开单一细胞系以后在另一EGFR背景中仍然有效，同时具备与产品定位匹配的CNS能力。

如果产品进一步声称覆盖广泛奥希替尼耐药，则还需要在经过分型的长期诱导或旁路耐药模型中证明药效。

如果产品主打延缓耐药，核心终点则应继续推进到复发时间和停药后的durability。

只有模型和产品定位完全对应，耐药动物数据才真正具有开发决策价值。

1、可以根据候选药定位选择C797S或长期诱导耐药模型

针对第四代EGFR-TKI、MET旁路组合、广谱耐药药物以及耐药预防方案，确定更适合的第一模型和第二模型。

2、可以建立C797S定义型NSCLC模型

根据项目选择Ex19del、L858R、T790M及C797S不同组合，建立机制清晰的细胞和CDX体系，用于第四代EGFR抑制剂评价。

3、可以开展长期奥希替尼耐药诱导

通过持续或递增药物压力建立PC9、H1975等奥希替尼耐药细胞，并对耐药倍数和稳定性进行验证。

4、可以开展耐药机制分型

根据项目分析EGFR相关改变、MET及其他旁路信号和细胞状态变化，避免将机制未知的耐药株直接投入正式动物实验。

5、可以建立标准化耐药CDX

通过固定接种细胞数、肿瘤体积分层和随机给药，比较奥希替尼、候选药以及联合治疗的真实体内响应。

6、可以开展体内奥希替尼耐药确认

在正式候选药评价前先验证模型对奥希替尼的反应，确保“耐药模型”在动物阶段仍然保持目标表型。

7、可以开展肿瘤PK/PD

同步评价血浆和肿瘤组织暴露，并检测p-EGFR及相关下游PD，将剂量、暴露和退瘤效果连接。

8、可以开展不同给药频次和治疗窗口比较

根据PD持续时间比较QD、BID或其他给药方式，为候选药临床给药策略提供依据。

9、可以开展长期治疗和耐药复发研究

针对耐药延缓和联合候选药，从敏感肿瘤开始持续治疗，评价肿瘤缓解深度和time to progression。

10、可以开展停药再生长研究

对达到深度缓解的候选药进行停药观察，比较不同方案残余肿瘤重新启动的速度和比例。

11、可以开展残余瘤和复发瘤机制研究

对治疗后残留及再次进展肿瘤进行分子检测，分析原有耐药机制是否持续以及是否出现新的旁路选择。

12、可以开展不同EGFR背景交叉验证

第一套C797S模型阳性以后进一步更换Ex19del/L858R、T790M状态或另一耐药背景，降低单一细胞系特异性。

13、可以开展脑穿透相关PK评价

针对CNS定位第四代EGFR药物，比较血浆和脑组织暴露，提前筛除脑穿透不足的候选分子。

14、可以根据项目建立颅内NSCLC模型

对具有脑转移治疗定位的候选药进一步评价脑内耐药肿瘤药效，使皮下药效与CNS转化形成连接。

15、可以设计第一模型和第二模型开发路线

定义型C797S模型负责验证候选药设计是否成立，长期诱导或旁路耐药模型进一步挑战临床耐药复杂性，让每一套模型承担清楚的开发任务。

NSCLC奥希替尼耐药模型真正需要解决的，从来不只是“怎样做出一只奥希替尼不敏感的皮下瘤”。

直接构建C797S和长期药物诱导，代表的是两个不同层面的开发问题。

前者把耐药原因固定下来，非常适合第四代EGFR-TKI回答最核心的问题：C797S出现以后，这个分子还能不能重新压住EGFR。

后者把耐药形成的选择权交给肿瘤，让细胞在长期奥希替尼压力下自己寻找生存路径。它得到的模型更复杂，也更容易暴露旁路信号和细胞状态适应，因此更适合检验候选药离开单一C797S以后还能覆盖多少真实获得性耐药。

所以对于一款第四代EGFR-TKI，更合理的顺序通常是先把C797S做干净。

先证明酶活、细胞、CDX和肿瘤PK/PD全部成立，再增加不同EGFR突变背景以及CNS挑战。

如果产品的临床定位还要继续向“广谱奥希替尼耐药”扩展，再让它进入经过分子分型的长期诱导耐药模型。

反过来，如果产品从一开始就是MET等旁路联合方案，则没有必要为了“奥希替尼耐药”这个标签，硬把C797S作为唯一核心模型。

模型最终应该服务产品。

一套好的耐药模型，真正需要告诉企业的是候选药到底解决了哪一种耐药、能够覆盖多少患者，以及离开最有利的那一个耐药机制以后，药效还能不能保留下来。

这才是C797S模型和长期诱导模型最有价值的分工。