结肠癌候选药完成第一套动物实验以后，很容易进入一个看似顺理成章的阶段：再找一个模型重复一次。

第一套MC38有效，第二套换CT26；第一套皮下CDX有效，再换一个细胞系继续做皮下；第一个剂量和周期跑通以后，再把模型时间拉长一些。

这些实验能够提高结果重复性，却未必真正降低候选药开发风险。

对于CRC来说，第二模型真正有价值的地方，在于主动改变第一模型中最容易帮助候选药成功的那一层条件。

如果第一模型是PD-1敏感的免疫热肿瘤，第二模型应该增加MSS、T细胞排斥或者髓系抑制；如果第一模型是定义非常清楚的BRAF或KRAS驱动模型，第二模型应该增加临床常见的反馈激活或者获得性耐药；如果第一模型通过脾内注射快速形成肝转移，第二模型就应该把原发瘤侵袭和自然播散重新放回来；如果第一模型只证明大肿瘤可以被缩小，而产品未来准备进入术后辅助治疗，第二模型则应该进入微小残留和复发场景。

因此，第二模型并没有固定答案。

真正需要先回答的是：

第一模型最容易把候选药的哪一面放大，又漏掉了哪一个最可能造成临床失败的因素。

找到这个缺口以后，第二模型才开始真正参与Go/No-Go决策。

第一模型通常追求效率。

模型成瘤稳定、窗口清楚、历史数据充足，能够快速判断候选药有没有基本体内活性。

这一步非常重要。

如果一个分子连最匹配机制的第一模型都无法获得足够target engagement和药效，没有必要立即进入更复杂的体系。

第二模型承担的任务不同。

它更应该回答第一模型无法回答的问题。

例如一个PD-1联合候选药在MC38中效果很好，第二模型的价值不是证明“在另一个PD-1也很敏感的肿瘤里同样有效”，而是看它到了MSS、T细胞排斥或者髓系抑制背景还能不能工作。

一个抗肝转移候选药在脾内注射模型中明显减少肝结节，第二模型则应该判断它是否只阻断肝定植，还是对原发瘤侵袭、入血和自然肝转移也有作用。

因此，第二模型理想情况下至少改变一个关键维度：

驱动基因、免疫状态、器官环境、耐药机制、疾病阶段或者治疗场景。

改变得越有针对性，增加的信息越多。

第一套皮下CDX用Cell A，第二套换Cell B，确实能够排除部分细胞系特异性。

但如果两套模型仍然具有相似的靶点表达、相似的肿瘤位置、相似的免疫缺陷宿主和相同治疗起点，真正增加的主要是重复性。

对于早期项目，这种重复仍然有意义。

进入核心候选物阶段以后，它对临床风险的挑战往往有限。

例如一个靶向肿瘤细胞内在增殖通路的小分子，在两个皮下模型中都有效，可以增强对靶点普适性的信心。

如果候选药真正的问题是“进入肝转移灶以后暴露是否够”“MSS免疫环境下联合PD-1还能不能发挥作用”，继续更换第三个皮下细胞系不会解决这些问题。

所以第二模型选择不能只问“还有哪个细胞系能做”。

应该先问“第一套结果最容易在哪种临床环境下失效”。

一个实用的方法，是给第一模型做一次“反向复盘”。

首先看模型是不是过度匹配候选药机制。

例如TLR、BRAF、KRAS、EGFR等定义明确的靶向药，如果第一模型恰好极度依赖目标通路，阳性非常合理，但也可能高估患者中的普遍效果。

其次看模型是不是过度敏感。

MC38对免疫检查点阻断往往能够产生较明确响应，如果产品主打MSS免疫耐药，仅靠这一模型很难覆盖真实临床难题。

第三看模型有没有跳过候选药准备解决的疾病过程。

脾内注射直接把CRC细胞送进门静脉系统，适合肝定植，却跳过原发瘤侵袭和入血。

第四看治疗场景是否错位。

大体积皮下瘤适合评价成熟肿瘤治疗，却不能直接代表术后微小残留病灶。

最后再看宿主和器官环境。

皮下瘤、盲肠原位瘤和肝转移灶，即使使用相同肿瘤细胞，面对的血管、基质和免疫环境也不一样。

第二模型应该优先攻击这些最明显的缺口。

CRC免疫治疗最容易出现模型错位。

临床上真正对PD-1/PD-L1单药高度敏感的主要是MSI-H/dMMR人群，而绝大多数CRC属于MSS/pMMR。

因此，免疫候选药首先要明确临床定位。

如果产品只是希望增强已经存在的免疫反应，可以先在MC38等相对免疫活跃模型完成PoC。

如果候选药主打MSS免疫增敏、髓系抑制、T细胞进入肿瘤或者cold-to-hot转换，第二模型就应该明显降低PD-1基础敏感性。

这时模型最重要的参数已经不只是成瘤速度。

需要重新评估anti-PD-1 baseline、CD8⁺T细胞浸润、髓系细胞组成以及候选药真正准备改变的免疫障碍。

不同模型之间是否属于MSS，只是第一层筛选。

真正决定第二模型价值的是它有没有把目标免疫耐药表型做出来。

MC38是非常好用的CRC免疫模型，也正因为如此，它很容易成为一种舒适区。

假设anti-PD-1单药已经产生60%～80%的TGI，候选药联合后提高到90%。

这个数据可以证明candidate具有免疫增效潜力。

如果产品未来的临床定位却是“让PD-1几乎无效的MSS CRC重新响应”，这套模型没有真正测试最核心的产品主张。

第二模型可以选择经过本平台确认的PD-1低响应MSS模型，例如CT26或其他更偏免疫排斥的体系，但不能只看文献标签。

正式项目最好先跑PD-1 baseline。

如果第二模型中PD-1单药已经有很强作用，就没有真正增加耐药压力。

如果PD-1完全没有任何药效，也要确认候选药的机制是否有可能跨过这一障碍。

第二模型最好位于“临床困难，但仍可被候选药机制改变”的区间。

精准靶向药的第一模型通常应该尽量干净。

BRAF V600E候选药先在定义明确的BRAF V600E CRC背景完成target engagement和体内PoC，可以快速回答分子设计是否成立。

KRAS G12C也一样。

但CRC具有一个非常重要的特点：RTK反馈往往会显著影响MAPK通路抑制。

因此，第二模型不应该只是更换另一个同样高度依赖BRAF或者KRAS的敏感细胞。

更有价值的是主动加入临床反馈机制。

BRAF V600E CRC可以增加EGFR反馈再激活背景，评价候选药单药和EGFR联合之间的差异。

KRAS G12C也可以观察EGFR反馈后MAPK重新激活，并进一步评价KRAS+EGFR等联合策略。

如果候选药准备解决长期治疗后的获得性耐药，第二模型还需要继续进入持续用药筛选后的耐药体系。

第一模型回答“能不能打中驱动基因”。

第二模型则回答“CRC肿瘤会怎样把这条通路重新接回来”。

抗EGFR候选药的模型尤其适合按照临床治疗过程分层。

第一层是RAS/RAF等基础分子背景。

如果肿瘤从一开始就具有明确KRAS或NRAS激活突变，对EGFR阻断反应差，模型主要研究原发耐药。

第二层是治疗选择以后形成的获得性耐药。

可以从原本EGFR依赖的敏感细胞开始，通过长期cetuximab等压力建立耐药株，再分析RAS-MAPK再激活、EGFR胞外域改变或其他旁路。

两类耐药产品需要不同第二模型。

如果新药希望扩大到RAS突变人群，定义型突变模型更加直接。

如果候选组合主打延缓cetuximab治疗后复发，则应该保留长期药物选择过程。

对于Fc增强型抗体，还要进一步考虑宿主背景。

裸鼠和更深度免疫缺陷小鼠保留的NK、巨噬细胞效应不同，抗体Fc贡献可能随模型发生改变。

所以抗EGFR模型不仅要匹配癌细胞基因型，还需要匹配抗体真正的作用方式。

CRC肝转移是第二模型特别有价值的领域。

脾内注射可以把细胞迅速送入门静脉循环，在较短时间内形成相对稳定的肝转移，非常适合高效率评价肝定植、肝内生长以及已经形成的CRLM治疗。

这是一套很好的第一模型。

如果候选药准备声称“减少CRC发生肝转移”，下一步只继续做脾内模型就明显不够。

更有价值的是盲肠或结肠原位模型。

原位肿瘤需要先局部生长、侵袭、进入血管，再通过门静脉达到肝脏。

候选药能否在这个模型里继续降低肝转移，能够说明它的作用并不只发生在肝定植最后一步。

因此可以形成一个很清楚的模型分工：

脾内模型解决hepatic colonization。

原位自发转移解决完整程度更高的metastatic cascade。

抗转移结果最容易出现过度解释。

例如细胞脾内注射当天就开始给药，终点肝结节明显减少。

这个结果说明候选药影响了细胞进入肝脏以后的一段过程，可能包括循环存活、肝窦捕获、外渗和早期定植。

它并没有证明候选药能够阻止原发CRC侵袭和入血。

如果未来产品真正定位于已经存在肝转移患者的治疗，反而应该等肝内病灶建立后再开始给药。

所以同一个脾内模型还可以拆成两种设计。

Day 0治疗更偏转移预防和定植阻断。

肝病灶确认后治疗更偏established CRLM。

第二模型的价值不仅来自换模型，也来自换治疗阶段。

皮下瘤里的血管和免疫环境与肝脏差别很大。

肝脏拥有特殊的窦状血管、Kupffer细胞和免疫耐受环境。CRC进入肝脏以后，还会重新组织TAM、MDSC、肝窦内皮和成纤维细胞。

因此，候选药如果作用VEGF、CXCR2、TAM、MDSC、肝内皮或者PD-1联合，皮下模型阳性后进入肝转移模型具有很高价值。

第一模型可以告诉我们药物在一般实体瘤环境中有没有作用。

第二模型则进一步判断它面对肝脏这一特殊免疫器官以后还能不能有效。

对于明确主打CRLM的产品，这种器官环境变化通常比“再换一个皮下CRC细胞系”更重要。

如果目标患者同时存在肥胖和MASLD，后期甚至可以进一步增加脂肪肝背景，继续挑战肝脏髓系和代谢环境。

如果候选药针对Fusobacterium nucleatum、特定细菌代谢物、益生菌、工程菌或者菌群—免疫轴，皮下CRC模型通常存在明显边界。

肠道微生物最核心的生物学发生在肠腔、黏液层、上皮屏障和局部黏膜免疫环境。

把MC38或CT26种在背部皮下以后，即使动物仍然拥有肠道菌群，肿瘤已经失去了与肠腔微生物的直接空间关系。

因此，这类产品第一轮可以使用简化模型验证系统免疫作用，但核心第二模型应该逐渐进入结肠或盲肠原位。

如果需要人为建立特定菌，则还要进一步控制抗生素预处理、定植成功率和菌量。

这里第二模型真正增加的不是“位置更像临床”。

它把候选药原本声称的肠道微生态机制真正放回模型中。

如果候选药未来准备做术后辅助治疗，第一套大体积皮下瘤仍然很有价值。

它可以证明产品本身具有抗肿瘤活性。

第二模型就不应该继续让大瘤一直存在。

临床患者进入辅助治疗阶段时，原发肿瘤已经被切除，真正需要控制的是微小残留、播散细胞和未来复发。

更合理的第二模型可以先建立原位CRC，允许一定时间完成局部生长和潜在播散，再切除主要病灶。

术后给予候选药，观察局部复发、肝转移以及长期无瘤生存。

这类模型对短期TGI的依赖会大幅下降。

真正需要比较的是复发时间和复发比例。

如果产品定位发生变化，第二模型的主要终点也应该随之改变。

很多项目虽然换了第二模型，终点却仍然完全照搬第一套。

这是很容易丢失信息的一种设计。

免疫敏感皮下模型可以主要看TGI和免疫PD。

进入免疫耐药模型以后，响应比例、T细胞进入和髓系重塑可能比单一平均TGI更重要。

脾内肝转移模型可以看肝转移负荷。

进入原位自发转移以后，还需要考虑原发瘤负荷、肝转移发生率和转移数量。

术后MRD模型更应该看time to recurrence和无瘤生存。

耐药模型则需要关注time to progression、停药后的再增长以及残余肿瘤分子变化。

所以“换模型、不换终点”经常只完成了一半升级。

第二模型应该围绕新增风险重新定义success。

相同mg/kg，在不同模型中并不保证产生相同肿瘤暴露。

皮下瘤和肝转移灶的血供、组织间压力和血管通透性不同。

肝转移模型还可能改变肝功能和系统药代。

如果第二模型是MASLD背景，药物分布和肝清除又可能进一步变化。

抗体、大分子和纳米递送体系受到器官血管结构的影响尤其明显。

因此第二模型出现药效下降以后，不能立即判断候选药机制失效。

首先要确认药物有没有真正达到目标组织。

比较成熟的做法，是重新建立：

血浆暴露→目标组织浓度→target engagement→病理/功能终点。

如果第一模型有效、第二模型无效，但第二模型肿瘤组织暴露只有第一模型的一半，问题首先属于delivery和PK，而不一定属于靶点本身。

第二模型不只是药效复现，也是在测试药物进入另一疾病环境以后还能不能正常工作。

真正理想的第二模型，很少只是第一模型的复制品。

1、第一套皮下模型阳性以后，第二套只换另一个皮下细胞系，却称为“多模型充分验证”。

2、第一模型最大的风险是MSS免疫耐药，第二模型仍然选择一个PD-1高度敏感的体系。

3、MC38联合PD-1药效很好以后，直接外推大多数MSS/pMMR CRC患者。

4、只根据“CT26是MSS”选择第二模型，没有先建立本平台PD-1 baseline。

5、BRAF或KRAS候选药第二模型只改变细胞系，没有加入CRC中特别重要的EGFR反馈。

6、精准靶向药使用的同系模型本身不具备目标驱动基因，却因为“免疫完整”继续用于核心药效。

7、第一套脾内肝转移阳性后，第二套继续脾内注射，仅改变细胞数。

8、脾内模型从Day 0开始给药，最后直接声称能够治疗已经形成的CRC肝转移。

9、原位模型中候选药减少肝转移，却没有控制原发瘤明显缩小带来的间接影响。

10、原发瘤负荷下降很多以后，所有转移减少都直接定义为“直接抗转移”。

11、皮下免疫药阳性后没有进入肝转移，却直接开发CRLM免疫适应症。

12、抗血管药在皮下瘤有效，就默认肝窦和CRLM血管环境中会产生相同药效。

13、微生物候选药始终只做皮下CRC，没有确认目标菌真正进入肿瘤相关肠道生态。

14、抗生素预处理被当成简单技术步骤，没有考虑它本身已经改变宿主免疫。

15、辅助治疗候选药第二模型仍然使用持续存在的大体积原发瘤。

16、模型换成术后复发后，仍然把TGI作为主要终点，没有改成复发率或复发时间。

17、第二模型药效下降以后立即判断靶点失败，没有检查肿瘤组织暴露。

18、第一和第二模型使用完全不同给药暴露，却只比较相同mg/kg。

19、第二模型为了追求“更难”做得过重，最终所有动物迅速进展，候选药没有可干预窗口。

20、第二模型选择依据只有“文献常用”，没有明确它到底针对第一模型的哪一个缺口。

1、第一模型优先证明候选药能够工作

选择与MOA高度匹配、成模稳定的体系，先完成剂量、PK/PD和基础疗效。

这一步追求清楚和高效率。

2、第一轮结束以后先做模型风险复盘

分析药效有多少可能来自模型过度敏感、靶点高表达、免疫热环境、人工定植或者特殊宿主。

把最大风险写出来。

3、第二模型只解决最重要的一两个风险

不要为了“复杂”同时更换细胞、宿主、部位、剂量和治疗时间。

变量太多以后，结果变化反而无法定位来源。

4、免疫药从响应型向耐药型升级

PD-1响应模型完成机制PoC后，进入经过本平台确认的MSS低响应模型。

候选药主打髓系时，再增加与髓系抑制匹配的模型。

5、精准靶向药从驱动依赖向反馈和耐药升级

BRAF、KRAS、EGFR第一模型先做干净的target dependency。

第二模型主动加入EGFR反馈、旁路激活或长期耐药。

6、抗转移药从人工定植向自然转移升级

脾内模型先快速验证肝定植作用。

核心候选物进入盲肠/结肠原位，判断完整转移链条中是否仍然有效。

7、器官微环境药从皮下向目标器官升级

抗血管、髓系、免疫和肝转移候选药逐渐进入CRLM环境。

根据目标患者进一步增加MASLD等宿主背景。

8、微生物产品进入真实肠道生态

控制菌群、定植和抗生素条件，并使用能够形成肠道局部肿瘤的模型。

保证候选药真正面对目标微生物—肿瘤界面。

9、辅助治疗产品从大瘤转向MRD

先证明成熟肿瘤药效，再通过原发瘤切除后的模型评价复发预防。

终点同步转成无瘤生存和转移控制。

10、第二模型重新建立PK/PD

不能用第一套模型的血浆PK直接解释全部结果。

根据新器官和疾病状态补充目标组织暴露。

11、第二模型阴性以后先判断失败发生在哪一层

依次排查暴露不足、target engagement不足、机制被旁路补偿，以及目标病理本身是否存在。

避免看到TGI下降就直接判定靶点无效。

12、必要时增加第三层正交验证

只有核心候选药才需要继续升级。

例如免疫产品从MSS皮下进入原位，肝转移产品从正常肝进一步进入MASLD背景。

每升一级都应该回答新的临床风险。

13、形成产品自己的Go/No-Go标准

免疫药关注在耐药背景下能否重新获得PD-1响应。

靶向药关注反馈和获得性耐药能否被控制。

肝转移产品关注established metastasis能否治疗。

辅助治疗产品关注复发时间。

不同产品不应该使用统一TGI阈值判断成功。

14、最终让模型逐渐接近临床，而不是一开始就追求最复杂

好的模型路线通常从简单走向复杂。

第一模型负责把候选药优势做清楚。

第二模型主动暴露风险。

如果产品还能继续保持药效，再进入真正决定临床竞争力的疾病场景。

这比一开始就在一个极其复杂、结果高度波动的模型中筛所有候选物更加高效。

1、可以根据第一模型结果反推第二模型

结合候选药MOA、第一模型药效和潜在转化风险，判断第二轮应该改变免疫背景、驱动基因、耐药机制、器官位置还是疾病阶段。

2、可以开展CRC同系免疫模型

根据产品定位选择MC38、CT26及其他适合模型，并先建立anti-PD-1 baseline，区分响应型和低响应型环境。

3、可以开展MSS免疫耐药相关验证

针对PD-1联合、TAM、MDSC和T细胞浸润候选药，选择更匹配的免疫抑制背景，并开展肿瘤免疫流式和组织PD。

4、可以建立定义型靶向药模型

针对BRAF、KRAS、EGFR等候选药，根据实际驱动背景设计CDX或同系体系，避免模型遗传背景与产品MOA冲突。

5、可以开展获得性耐药模型

通过长期药物压力建立EGFR、KRAS、BRAF相关联合或其他候选药的耐药体系，并在进入动物前完成耐药机制确认。

6、可以建立脾内CRC肝转移模型

用于快速评价肝定植、肝内生长和已经形成的肝转移病灶治疗，并根据项目控制是否切脾和治疗起点。

7、可以开展盲肠或结肠原位模型

用于研究原发瘤局部生长、侵袭和自然肝转移，使抗转移候选药面对更加完整的疾病过程。

8、可以开展CRC肝转移免疫评价

针对髓系、PD-1联合、抗血管和肝转移微环境候选药，评价肝内TAM、MDSC、T细胞及相关target engagement。

9、可以根据项目增加代谢性肝病背景

针对明确面向肥胖、MASLD或髓系免疫环境的候选药，在普通CRLM阳性后进一步增加宿主肝脏风险。

10、可以开展微生物相关CRC模型

根据项目控制抗生素、目标菌定植和肠道原位环境，将微生物组候选药真正放回目标生态中评价。

11、可以开展术后复发和辅助治疗模型

通过原发瘤切除后给药观察复发、肝转移和长期无瘤生存，用于MRD和adjuvant定位候选药。

12、可以开展第二模型组织PK/PD

针对皮下、原位和肝转移等不同环境重新检测血浆和目标组织暴露，并将药物浓度与target engagement和药效连接。

13、可以开展第二模型治疗起点优化

根据候选药属于转移预防、已形成转移治疗、耐药后治疗或辅助治疗，调整给药时间，使动物场景与未来临床使用位置一致。

14、可以根据第二模型结果继续定位失败原因

如果第一模型阳性、第二模型药效减弱，可进一步从组织暴露、靶点抑制、旁路激活、免疫环境和器官微环境逐层排查，避免直接把复杂模型中的阴性结果等同于靶点失败。

CRC候选药第一模型阳性以后，最容易做的一件事，就是寻找第二个“也容易阳性”的模型。

这种结果看起来很稳，却不一定真正帮助企业减少临床开发风险。

第二模型更有价值的作用，是主动寻找候选药最可能失败的地方。

MC38里PD-1联合效果很好，就去看看MSS低响应环境还能不能有效。

定义型BRAF、KRAS模型里退瘤很强，就去挑战EGFR反馈和获得性耐药。

脾内肝转移明显减少，就进入盲肠原位模型，看看完整转移链条中还能不能保持作用。

皮下髓系或抗血管药有效，就把药放进真正CRLM肝脏微环境。

大瘤治疗效果很好，而临床最终准备做辅助治疗，就切掉原发瘤，让候选药真正面对MRD和复发。

这样设计以后，第二模型产生阴性结果也不一定是一件坏事。

它可能提前告诉开发团队，这款药脑中想象的产品定位太宽、某个器官暴露不够、某种耐药背景无法覆盖，或者真正适合的人群需要进一步收窄。

这些信息如果等到临床阶段才出现，代价会大得多。

所以CRC候选药的第二模型真正应该回答的，并不是：

这个药能不能再阳性一次。

更重要的问题是：

当第一模型最有利于候选药的条件被拿掉以后，它还能不能继续工作；如果不能，究竟是哪一层临床风险首先暴露出来。

这才是第二模型真正能够增加的开发价值。