下一代CML TKI做到临床前阶段，T315I几乎是绕不开的一道门槛。

对于ATP结合位点TKI而言，T315I位于BCR::ABL1激酶结构中的关键位置，可以显著削弱多种早期TKI的结合能力。因此，一个新分子如果准备进入多线TKI耐药或者T315I阳性CML，首先证明能够压住T315I非常合理。

但今天的研发环境已经和早期不同。

ponatinib、asciminib、olverembatinib等药物已经让“能够抑制单一T315I”逐渐从差异化优势变成后线CML候选药必须具备的基础能力。真正接受过多轮TKI治疗的患者，还可能在持续药物选择压力下形成更复杂的BCR::ABL1突变组合。

其中非常值得关注的一类，就是T315I叠加P-loop区域突变，例如T315I+E255V、T315I+Y253H。

这类compound mutation带来的问题并非简单地“多了一个突变”。多个氨基酸变化出现在同一个BCR::ABL1激酶分子后，会进一步改变构象、ATP位点和药物结合环境。一个候选药对单一T315I仍然保持很强活性，进入T315I+E255V或T315I+Y253H以后，细胞活性和体内有效暴露可能明显恶化。

所以对于下一代TKI，真正需要解决的问题已经逐渐从：

“能不能打T315I”

推进到：

“面对更复杂、由既往治疗选择出来的BCR::ABL1突变组合，还能保留多少活性和治疗窗”。

这也决定了单一T315I和compound mutation模型在开发中的位置不同。

单一T315I更适合早期把药理做干净，compound mutation则更适合候选物收敛以后真正拉开产品差距。

T315I虽然已经不是最新的耐药问题，但它仍然非常适合作为下一代TKI的第一道筛选关口。

原因在于它机制明确。

如果一个候选分子设计上希望克服传统ATP位点TKI的耐药，单一T315I能够非常直接地检验分子有没有实现预期结构设计。

早期可以使用BCR::ABL1 WT和T315I进行平行比较，同时加入常见P-loop、F359等突变，快速画出候选物的mutation sensitivity profile。

进入动物以后，再选择定义清楚的T315I模型建立PK/PD。

如果药物能够在合理暴露下稳定压制BCR::ABL1及下游信号，并改善白血病负荷，就说明分子已经具备继续向复杂耐药推进的基础。

这一阶段模型越干净越好。

因为如果候选药连单一T315I都需要非常高暴露才能压制，直接进入compound mutation通常只会放大问题，很难提供新的开发价值。

单一T315I过去代表极高未满足需求。

现在情况发生了变化。

已有多种后线药物能够覆盖T315I，所以新一代TKI即使在T315I模型中做到明显抑瘤，也首先证明“达到行业基础门槛”。

企业真正需要继续回答的是竞争优势。

例如候选药是否能够降低对野生型ABL或其他激酶的非目标作用，是否具有更宽的有效暴露窗口，能否覆盖更复杂的compound mutation，以及是否能够在既往ponatinib、asciminib等药物压力下仍保留活性。

如果产品定位仍然只是“可以治疗T315I”，临床差异化空间会越来越有限。

因此，T315I阳性以后继续在同一个模型把剂量从10 mg/kg增加到30 mg/kg，信息增量已经很有限。

真正值得做的是增加更难的突变背景。

E255V和Y253H都位于BCR::ABL1 P-loop区域。

P-loop本身参与ATP结合位点构象，对多类ATP竞争型TKI的结合非常重要。

当T315I与P-loop突变同时存在于同一个BCR::ABL1分子时，候选药面对的不再只有gatekeeper位点改变。

激酶整体构象和药物结合环境会进一步发生变化。

因此一个对T315I仍然保持纳摩尔级活性的化合物，在T315I+E255V或者T315I+Y253H中可能出现明显活性右移。

更关键的是，两个compound mutations之间也未必具有完全相同的药物敏感性。

所以企业做下一代TKI时，不适合建立一个“T315I compound mutation模型”以后就概括全部复合突变。

更合理的方法是先建立mutation panel，看哪几个compound mutation真正能够拉开候选药和现有参照药之间的差距，再选择体内模型。

实验里检测到T315I和E255V同时存在，并不自动代表T315I/E255V compound mutation。

可能存在两种情况。

一种是两个突变位于同一个BCR::ABL1等位分子上，也就是cis compound mutation。

另一种是肿瘤里同时存在两个不同克隆，一个携带T315I，另一个携带E255V。

这两种情况下，候选药面对的药理问题完全不同。

前一种是在同一激酶分子上同时处理两个结构改变。

后一种则是同时面对两个独立耐药克隆。

因此直接构建模型时，应该明确建立真正的cis compound mutant。

如果从长期药物诱导或临床样本衍生体系中发现多个突变，则需要通过能够区分等位关系的方法进一步确认。

否则很容易把“多克隆耐药”误写成“复合突变耐药”。

compound mutation越复杂，越不适合作为最早期的大规模筛选模型。

一个新系列化合物刚开始进入体内时，最重要的是快速知道基本问题出在哪里。

如果单一T315I已经显示良好细胞活性，但体内无效，可以优先检查PK、骨髓暴露和target engagement。

如果一开始就使用T315I+E255V，药效不足时很难快速判断是基础药代不够、T315I覆盖不足，还是P-loop突变进一步降低了分子结合能力。

因此更高效的漏斗应该是：

先做WT和单突变谱，再做compound mutation体外筛选，最后挑最具区分度的复合突变进入动物。

复杂模型应该用来比较已经比较优秀的候选物。

它不适合替代早期筛选。

以下几类产品尤其值得尽早进入compound mutation。

第一类是明确定位于多线TKI失败后的下一代ATP位点抑制剂。

这类产品未来会直接面对经过多次治疗选择后的复杂克隆，单一T315I证据不足。

第二类是准备与ponatinib、asciminib等后线药物形成差异化的候选物。

如果现有参照药在T315I中已经很好，新药需要在更困难的突变上显示优势。

第三类是准备声称“broad mutant coverage”的产品。

只做WT、T315I和几个单点突变，很难支撑真正广谱覆盖。

第四类是联合治疗。

如果组合的设计目的是提高突变屏障、减少后续复合突变形成，就应该进一步进入compound mutant和多克隆模型。

这时compound mutation已经从附加模型变成产品定位的一部分。

Ba/F3体系非常适合突变药理筛选。

通过表达不同BCR::ABL1突变体，可以让细胞增殖高度依赖目标激酶，背景相对干净。

这种模型特别适合快速比较WT、T315I、E255V、Y253H以及不同compound mutations。

优势是可控。

缺点也很明显。

Ba/F3是小鼠来源细胞，不等同于真实人CML的复杂遗传背景。

因此核心候选物收敛以后，可以进一步加入KCL-22、K562等人源CML来源细胞及其工程化或药物诱导耐药模型。

需要注意的是，K562和KCL-22等经典细胞来源于CML急变期，适合耐药和药理研究，却不能直接代表慢性期CML完整疾病状态。

所以更合理的分工是：

Ba/F3负责mutation pharmacology。

人源模型负责验证候选药进入复杂白血病背景以后是否仍然有效。

系统性CML模型再负责疾病层验证。

患者接受多线TKI以后，真正存在的往往不只有一个耐药克隆。

可能同时存在T315I、T315I+E255V、T315I+Y253H以及其他低频亚克隆。

治疗以后，不同药物会给这些克隆完全不同的选择压力。

某个药可以非常强地压制主克隆，却给另一个原本比例很低的compound mutant留下生长空间。

几周以后，低频克隆就可能成为新的主导耐药群。

所以单克隆模型最适合回答“这一种突变对药物有多敏感”。

当项目进一步进入联合疗法和后线耐药管理，就值得增加多克隆混合模型。

这类实验真正关注的已经不只是总白血病负荷。

还要观察治疗过程中每一个耐药克隆的比例怎样变化。

一个候选药是否容易选择出更加难治的克隆，本身就是重要开发信息。

compound mutation更常见于经历多线治疗和明显克隆进化的复杂病例。

这使很多研究自然使用CML-BP或高度耐药细胞体系。

但候选药最终的临床定位仍然需要明确。

如果产品主要定位CML慢性期多线失败患者，模型应该尽量保留慢性髓系疾病、骨髓和脾脏负荷，而不能完全依赖急变期皮下实体瘤。

如果产品准备进入CML-BP，单纯BCR::ABL1突变又不够。

急变期通常还伴随额外的分化、细胞周期、凋亡和克隆异常。

所以同一个compound mutation，在CML-CP和CML-BP背景中的药物响应可能并不完全一样。

企业应该先确定适应症阶段，再决定复杂模型做到哪一层。

一个高效率的下一代TKI项目，不应该为每一个突变都建动物模型。

体外先做完整mutation panel更合理。

可以至少覆盖WT、T315I、Y253H、E255V等关键单突变，再加入T315I+Y253H、T315I+E255V以及其他产品重点关注的compound mutations。

比较不同化合物的细胞IC50/IC90以后，会得到一张非常清楚的敏感性地图。

下一步挑动物模型时，应该优先选择三类突变。

第一类是临床价值高的。

第二类是最能拉开候选药和参照药差异的。

第三类是候选药最薄弱、最值得提前暴露风险的。

动物模型不需要重复整个体外panel。

它应该专门回答最关键的开发问题。

早期药化经常大量比较IC50。

到了耐药候选物阶段，IC50已经不够。

临床真正需要的是持续深度压制BCR::ABL1克隆。

一个候选药IC50看起来只比参照药好两倍，但在高浓度区间仍然能够保持陡峭抑制，可能具有很好的IC90。

另一款药IC50不错，到了T315I+E255V以后曲线明显变平，想达到90%以上抑制需要极高浓度。

两者体内潜力差异很大。

所以进入候选物确认以后，最好逐渐把mutation-specific IC90和free drug exposure连接。

真正要比较的是：

安全可达到的游离暴露，能够覆盖目标复合突变IC90多少倍、持续多长时间。

这比单纯比较mg/kg更接近临床剂量选择。

CML系统模型中WBC下降非常直观。

但一款非特异性骨髓抑制药同样可以迅速降低白细胞。

所以候选药真正的抗白血病效应需要和正常造血毒性拆开。

除了外周血，还可以进一步评价BCR::ABL1阳性细胞负荷、骨髓和脾脏受累、相关分子PD以及正常HSPC状态。

如果使用带有可追踪标记的工程细胞，可以动态评价白血病克隆负荷。

如果候选药主打深度清除，还可以进一步关注停药后复发。

对于复合突变模型，单纯“WBC从50降到10”无法告诉我们究竟哪个克隆被压下去了。

一旦进入多克隆体系，还需要增加突变克隆比例分析。

下一代TKI的阳性对照不能只选imatinib。

如果产品准备进入T315I和多线耐药，参照药应该能够代表当前真实竞争环境。

ponatinib可以作为ATP位点广谱后线TKI的重要参照。

asciminib通过myristoyl pocket进行变构抑制，提供另一种完全不同的结合机制。

如果项目在国内进一步考虑T315I竞争格局，也可以根据产品定位选择更相关的临床参照。

参照药真正的任务不只是证明模型能被治疗。

更重要的是帮助企业判断候选药的差异化在哪里。

如果单一T315I中候选药和现有药差异很小，而T315I+E255V中明显优于参照，这就是非常有价值的产品信息。

反过来，如果只有提高到明显更高暴露以后才能获得相同药效，安全窗压力也需要提前进入决策。

工程化compound mutant细胞移植以后，如果从接种当天开始给药，候选药同时干预细胞归巢、植入和早期扩增。

这种设计适合预防性PoC，却与临床已经存在耐药CML后的治疗存在距离。

核心候选物更适合先让白血病负荷稳定建立。

可以根据外周血、BCR::ABL1阳性细胞比例、脾大或者其他预设指标确认模型成立，再随机进入治疗。

此时候选药面对的是已经建立的compound mutant白血病。

如果产品准备做“耐药延缓”，实验设计又要改变。

需要从相对敏感克隆开始持续治疗，观察多久出现复合突变克隆扩张。

所以治疗既有耐药和阻止耐药形成，是两个不同模型问题。

这条路线的核心，是让模型随着候选药成熟不断增加压力。

第一模型证明候选药能工作。

后面的模型负责判断它到底能够走多远。

1、单一T315I模型阳性以后直接声称候选药能够覆盖多线TKI耐药CML。

2、检测到T315I和E255V同时存在，就直接定义为compound mutation，没有确认两者是否位于同一BCR::ABL1分子。

3、把所有T315I compound mutations当成一种模型，没有分别评价Y253H、E255V等不同组合。

4、一开始就使用最复杂compound mutation动物模型筛大量候选物，结果阴性后无法定位是药代、基础活性还是突变覆盖问题。

5、只做Ba/F3工程细胞，就直接外推人源CML复杂耐药背景。

6、只做人源K562/KCL-22皮下模型，就直接声称模型代表慢性期CML。

7、compound mutation模型建立以后没有保留基因型QC，长期传代后仍默认突变比例完全不变。

8、细胞IC50明显升高以后立即进入动物，没有先判断候选药能否在安全暴露范围覆盖IC90。

9、只比较总药物浓度，没有使用游离暴露分析mutation coverage。

10、不同TKI使用相同mg/kg直接横向比较强弱，没有考虑PK差异。

11、外周血WBC下降以后直接解释成抗白血病，而没有排除正常骨髓抑制。

12、单克隆模型药效很好，就认为治疗后不会选择出其他compound mutant亚克隆。

13、多克隆模型只看总白血病负荷，没有分析不同突变克隆比例。

14、候选药设计上声称提高耐药屏障，却只使用已经建立的耐药模型，没有评价耐药出现时间。

15、从细胞移植当天开始给药，却将结果解释成治疗既有多线耐药CML。

16、compound mutation项目只设置imatinib作为阳性药，没有与当前后线治疗形成真正比较。

17、候选药对T315I+E255V效果下降以后，简单认为靶点失败，没有先确认骨髓暴露和target engagement。

18、第一模型阳性以后继续增加同一T315I模型剂量，没有真正升级到compound mutation。

1、先定义产品的临床位置

如果产品主要是新的早线TKI，单一突变覆盖和安全性可能更加重要。

如果产品准备进入多线失败、T315I甚至现有后线TKI治疗后人群，compound mutation应该尽早进入开发规划。

2、先做完整mutation sensitivity map

用统一体系比较WT、单突变和重点compound mutations。

这一阶段快速筛掉对关键耐药突变覆盖不足的分子。

3、把mutation IC90和free exposure接起来

不能只看哪个化合物IC50最低。

需要同时结合药代和安全窗判断体内能否持续覆盖关键突变。

4、第一体内模型优先选择单一T315I

用于确认候选药基础耐药药理、PK/PD和剂量关系。

如果这一层无法形成稳定治疗窗，没有必要马上升级更复杂模型。

5、核心候选物进入T315I+E255V/Y253H

优先选择体外最有区分度、临床意义高的复合突变。

评价候选药能否在不大幅增加暴露的情况下保持疾病控制。

6、增加当前后线治疗作为参照

把候选药放进真实竞争环境。

重点比较有效暴露、target engagement、疾病控制深度以及治疗窗。

7、从工程突变进入人源耐药背景

如果候选药在干净工程模型中成立，再通过人源CML模型验证复杂细胞背景下药效。

避免长期依赖单一Ba/F3结论。

8、从单克隆进入多克隆竞争

对于准备进入真正多线耐药市场的核心候选物，进一步混合多个关键耐药克隆。

观察治疗以后哪个克隆被压制、哪个克隆被选择出来。

9、将骨髓提高到核心组织

系统性CML真正残留疾病主要位于骨髓和脾脏。

核心阶段需要建立骨髓暴露、BCR::ABL1 PD和克隆负荷关系。

10、把正常造血毒性和抗白血病作用拆开

同时观察正常血细胞、HSPC和候选药安全窗口。

强力压低WBC本身不能作为下一代TKI优势。

11、根据产品设计联合方案

如果单一ATP位点TKI仍容易被compound mutation逃逸，可以进一步评价与STAMP类药物等不同结合位点组合。

核心目标是提高突变屏障，而非单纯把短期药效叠加得更高。

12、需要时增加长期治疗和克隆演化

从较敏感疾病开始持续给药，观察不同治疗方案出现耐药的时间和突变谱。

这一步更适合“延缓耐药”产品定位。

13、增加停药或低疾病负荷挑战

如果产品进一步声称能够获得更深疾病控制，可以在明显低负荷后停药观察复发。

看看是否仍有少量compound mutant克隆重新扩张。

14、形成真正的Go/No-Go证据链

一个准备进入后线CML竞争的下一代TKI，理想状态下应该先证明WT和单突变活性完整，随后在单一T315I中建立稳定体内PK/PD，再进入T315I+E255V、T315I+Y253H等compound mutation。

如果产品定位进一步覆盖多线TKI失败，则应通过人源耐药背景和多克隆竞争验证药效。

最终判断标准不只是“哪只动物白细胞降得更多”，而是候选药能否在安全可达暴露下持续压制最困难的BCR::ABL1克隆，同时不给正常造血留下过高代价。

1、可以根据候选药定位设计BCR::ABL1突变模型路线

针对早线TKI、T315I、多线耐药和compound mutation不同临床定位，设计从单突变到复合突变的分级验证体系。

2、可以建立BCR::ABL1工程突变细胞模型

根据项目建立WT、T315I、Y253H、E255V以及T315I+Y253H、T315I+E255V等定义型模型，用于体外药物敏感谱比较。

3、可以开展mutation panel筛选

对多个候选化合物统一评价不同BCR::ABL1突变背景下的IC50、IC90，提前筛选最值得进入动物的compound mutations。

4、可以建立单一T315I体内模型

用于候选药早期PK/PD、有效剂量、给药频次和基础耐药药效确认。

5、可以建立compound mutation体内模型

针对候选物收敛阶段进一步使用T315I+E255V、T315I+Y253H等模型，评价复杂突变对体内疗效和暴露窗口的影响。

6、可以开展人源CML耐药模型验证

在定义型工程模型完成PoC以后，进一步使用适合的人源CML耐药细胞验证候选药在复杂遗传背景中的药效。

7、可以开展多克隆混合竞争研究

根据项目混合不同突变克隆，评价治疗过程中各耐药克隆比例变化，判断候选药是否容易选择出新的优势克隆。

8、可以开展系统性白血病负荷评价

根据模型观察外周血、骨髓和脾脏疾病负荷，减少单纯皮下实体瘤对CML药效解释的限制。

9、可以开展BCR::ABL1 target engagement

评价p-BCR::ABL1及相关下游信号，并将PD持续时间与血浆、骨髓暴露和疾病控制连接。

10、可以开展血浆和骨髓PK/PD

针对CML核心残留部位评估真实组织暴露，确认候选药在骨髓中的有效浓度能够覆盖目标compound mutation。

11、可以开展正常造血安全窗口评价

结合血常规、骨髓和必要HSPC指标，区分真正抗CML作用与非特异性骨髓抑制。

12、可以开展不同后线TKI参照研究

根据产品竞争定位设置ponatinib、asciminib或其他适合的临床参照，比较下一代候选药的差异化窗口。

13、可以开展联合用药研究

针对ATP位点TKI与STAMP或其他耐药克隆依赖通路组合，评价单药、联合以及不同给药顺序。

14、可以开展长期耐药和克隆演化研究

对于主打提高耐药屏障的方案，持续治疗并追踪疾病进展和耐药克隆变化，比较不同治疗策略的time to resistance。

15、可以根据第一模型结果设计第二模型

单一T315I阳性以后进一步进入T315I+E255V或T315I+Y253H；单克隆阳性以后升级多克隆；工程模型阳性后进入人源耐药体系，使每一轮模型真正增加新的开发信息。

单一T315I和T315I+E255V/Y253H并不适合被简单理解成“一个容易、一个更难”的两套CML模型。

它们承担的是不同开发阶段的任务。

单一T315I最适合证明下一代TKI是否具备进入后线CML竞争的基础能力。模型干净，药理因果明确，也方便建立mutation-specific PK/PD。

compound mutation则更适合候选物已经收敛以后真正拉开差异。

此时企业需要知道的已经不只是药物能不能绕过一个gatekeeper mutation，而是在多个关键结构位点同时改变以后，候选药还能不能在安全可达暴露下持续压住BCR::ABL1。

再往后，问题还会继续升级。

患者并不一定只有一个compound mutant克隆。治疗本身还会重新选择克隆，今天比例很低的耐药亚群可能成为下一轮复发的主要来源。

所以真正准备进入多线耐药CML的新一代TKI，模型路线也应该逐渐从：

单突变，

走到复合突变，

再走到多克隆竞争和系统性骨髓疾病。

最终企业真正需要回答的问题，已经不是：

这款药对T315I有没有活性。

而是：

在已经有多种T315I有效药物的今天，当CML经过多轮治疗继续演化出更困难的BCR::ABL1复合突变时，这款新药还能不能保持足够强、足够持久，同时真正具有可用于患者的治疗窗。

这个答案，才是compound mutation模型真正应该为下一代TKI开发提供的价值。