基础科研实验中，经常会遇到这样一个问题：

研究某个目标分子，到底应该做WB、ELISA、PCR、免疫组化、免疫荧光，还是流式细胞术？

有些课题会把能做的方法全部安排一遍。

PCR检测目标基因mRNA，WB检测目标蛋白，ELISA检测样本中的分泌水平，免疫组化观察组织表达，免疫荧光再做一次定位，最后用流式细胞术统计阳性细胞比例。

检测方法很多，结果也很丰富，但整套实验未必回答了更多问题。

这些技术虽然都可以用于检测生物分子，却处在不同的观察层级。

PCR回答目标基因的转录水平是否变化；WB回答裂解样本中目标蛋白的丰度、分子量和部分修饰状态是否变化；ELISA更适合对血清、血浆、培养上清或组织匀浆中的可溶性分子进行定量；免疫组化保留组织结构，可以观察目标蛋白位于哪一类区域和病理结构；免疫荧光能够进一步分析亚细胞定位、共定位和空间分布；流式细胞术则把组织或培养细胞拆成单细胞，判断目标分子出现在哪一类细胞中，以及阳性细胞比例和单细胞表达强度如何变化。

所以，选择检测技术前，首先需要明确研究问题：

要检测mRNA还是蛋白？

要看样本整体平均水平，还是区分不同细胞亚群？

要获得浓度，还是比较相对表达？

要保留组织空间，还是进行单细胞定量？

要检测细胞表面、细胞内部、组织局部，还是分泌到细胞外的分子？

一个完整课题通常需要多种技术相互验证，但每一种方法都应承担不同任务。单纯增加检测平台，容易得到大量互相重复或难以解释的数据。

1、PCR：检测核酸水平

基础科研中用于表达分析的“PCR”，通常主要指RT-qPCR，也就是先将RNA逆转录为cDNA，再进行实时荧光定量PCR。

它检测的是目标基因mRNA相对表达量，适合回答目标基因的转录水平是否升高或降低。

PCR的优势是灵敏度较高、样本需求量相对较少、检测速度较快，也适合一次检测多个候选基因。

它提供的是核酸层面的结果，无法直接说明目标蛋白是否同步变化，也不能说明蛋白是否发生磷酸化、剪切、降解、膜转位或核转位。

2、WB：检测样本整体蛋白表达及分子量信息

Western blot先将样本中的蛋白按照分子量分离，再利用抗体识别目标蛋白。

它适合检测总蛋白、磷酸化蛋白、裂解片段、不同分子量形式及部分蛋白修饰。

WB能够回答目标蛋白是否增加或减少、条带分子量是否符合预期、磷酸化水平是否改变，以及某些蛋白是否发生剪切。

但WB通常检测的是细胞或组织裂解液中的平均信号。

它无法直接告诉研究者，这个蛋白来自哪一类细胞，也无法保留蛋白在组织中的空间位置。

3、ELISA：检测液体样本中的目标分子浓度

ELISA通过抗原—抗体反应和标准曲线，对血清、血浆、细胞培养上清、尿液、脑脊液或组织匀浆中的目标分子进行定量。

它尤其适合检测细胞因子、趋化因子、激素、抗体、分泌蛋白和部分代谢相关蛋白。

ELISA通常能够给出pg/mL、ng/mL等浓度结果，因此比WB更适合进行可溶性分子的绝对定量。

但ELISA不会提供目标蛋白的分子量，也无法显示蛋白来自哪一类细胞，更无法观察蛋白位于组织的哪个位置。

4、免疫组化：在组织结构中观察蛋白表达

免疫组化通常使用酶促显色系统，使目标蛋白在组织切片中呈现棕色或其他颜色信号。

它保留了组织结构，因此可以同时观察病灶区域、细胞形态和目标蛋白表达。

免疫组化适合回答：

目标蛋白位于肿瘤实质还是间质；

位于肾小球还是肾小管；

位于血管内皮、炎症区域还是纤维化区域；

药物干预后，阳性面积和染色强度是否改变。

免疫组化通常用于组织水平的半定量或定量分析，结果会受到抗体、抗原修复、显色时间、组织结构和图像分析规则影响。

5、免疫荧光：观察蛋白定位和多分子空间关系

免疫荧光使用荧光标记抗体检测目标蛋白，可以同时标记多个分子，并通过共聚焦显微镜观察亚细胞定位和空间关系。

它适合分析蛋白位于细胞膜、细胞质、细胞核还是某种细胞器，也适合观察两个蛋白是否位于同一区域。

在组织中，免疫荧光可以通过目标蛋白与细胞特异性标志物共染，判断信号来自哪一类细胞。

免疫荧光通常更适合空间定位和多标志物联合观察，但定量容易受到曝光参数、背景、自发荧光、切片厚度和取景规则影响。

6、流式细胞术：在单细胞水平分析细胞比例和表达强度

流式细胞术将细胞悬液逐个通过激光检测区域，通过荧光抗体识别细胞表面或胞内分子。

它可以同时检测多种标志物，对细胞进行分群，并分析每一类细胞的比例、绝对数量和平均荧光强度。

例如，可以研究CD45⁺免疫细胞中CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和其他亚群的变化，并进一步检测这些细胞中的PD-1、Ki-67、细胞因子或磷酸化信号。

流式细胞术的优势是单细胞、多参数和定量能力较强。

它需要把组织消化成单细胞悬液，因此会失去原始组织结构和空间位置。

1、mRNA变化与蛋白变化可能不同步

基因转录完成后，mRNA还需要经过加工、输出、翻译和蛋白成熟。

蛋白同时受到降解速度、亚细胞运输和翻译效率影响。

因此，mRNA升高后，蛋白可能没有明显增加；mRNA已经下降，已有蛋白也可能因为半衰期较长而继续存在。

如果目标蛋白的功能主要取决于快速磷酸化或亚细胞转位，mRNA变化与实际功能之间的距离会更大。

2、PCR不能检测蛋白磷酸化和剪切

很多信号通路并不通过总蛋白表达变化实现调控。

ERK、AKT、STAT3、NF-κB及Smad等通路，常通过蛋白磷酸化、核转位或复合物组装发挥作用。

PCR可以检测相关基因转录，却无法判断这些蛋白是否已经被激活。

细胞死亡研究中的Caspase、GSDMD、PARP等蛋白，还可能通过剪切产生活性片段。PCR无法检测这些蛋白加工过程。

3、PCR适合寻找转录层面的变化

当研究问题是某个转录因子是否调控目标基因、炎症刺激是否诱导细胞因子转录、候选药是否影响纤维化相关基因表达时，RT-qPCR具有较高价值。

如果研究结论涉及蛋白功能，通常还需要WB、ELISA、免疫染色或流式细胞术进行验证。

4、PCR内参需要根据实验条件验证

GAPDH、ACTB、18S等内参基因并非在所有实验中都稳定。

缺氧、代谢干预、细胞分化、炎症刺激和组织损伤都可能改变常用内参表达。

正式实验前应评估内参稳定性。对于关键研究，可采用两个或多个稳定内参进行归一化。

1、WB适合确认蛋白是否存在和大小是否正确

抗体检测到条带后，可以根据分子量判断其是否接近目标蛋白理论大小。

如果出现多个条带，需要考虑蛋白异构体、糖基化、剪切、聚合、降解或抗体非特异性。

这一点是ELISA、流式和普通免疫染色难以直接提供的。

2、WB适合检测磷酸化和裂解

研究信号通路时，可以同时检测总蛋白和磷酸化蛋白。

例如，分析p-STAT3/STAT3、p-AKT/AKT或p-ERK/ERK，更接近通路激活水平。

研究凋亡、焦亡和其他蛋白加工过程时，也可以检测Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、GSDMD-N等裂解片段。

需要注意，磷酸化蛋白和总蛋白应分别进行合理归一化。qPCR只能检测mRNA，不存在“磷酸化mRNA”这一概念。

3、组织WB反映的是多种细胞共同形成的平均值

一个肿瘤、肝脏、肾脏或脑组织中包含多种细胞。

目标蛋白可能只在少数免疫细胞中大幅升高，但由于这些细胞占比较低，全组织WB变化不明显。

也可能目标细胞中的蛋白下降，而炎症细胞浸润增加并表达较高目标蛋白，最终全组织条带反而升高。

因此，WB结果需要结合组织细胞组成解释。

4、核质分离和膜蛋白检测可以增加定位信息

如果研究转录因子核转位，可以进行核蛋白和胞质蛋白分离，再分别检测目标蛋白。

如果研究膜受体转位，可以开展膜蛋白分离。

这类方法能够提供亚细胞区室信息，但仍然属于样本整体平均结果，无法像免疫荧光那样直接观察单个细胞中的空间分布。

5、WB定量必须位于线性范围

条带越黑不代表结果越可靠。

曝光饱和后，真实表达量差异会被压缩，两组条带都可能接近相同黑度。

正式定量需要保证上样量、抗体浓度和曝光时间位于线性检测范围，并使用适合的总蛋白或内参进行归一化。

1、ELISA适合定量分泌和体液中的分子

细胞培养上清中的IL-6、TNF-α、IL-1β，血清中的激素、抗体和炎症因子，尿液中的肾损伤分子，通常适合使用ELISA检测。

ELISA通过标准曲线将光密度转换为浓度，适合比较不同样本中目标分子的绝对水平。

2、ELISA检测到的是样本中所有来源的总量

血清IL-6升高，无法说明它来自巨噬细胞、肿瘤细胞、内皮细胞还是其他组织。

细胞培养上清中的细胞因子升高，也可能来自细胞分泌增加，或者细胞死亡后胞内物质被动释放。

因此，ELISA结果需要与细胞活率、细胞数量及细胞来源验证结合。

3、组织匀浆ELISA会丢失空间信息

将组织匀浆后检测某个细胞因子，可以提高定量能力，但整个组织结构已经被破坏。

组织匀浆中目标分子增加，无法区分它集中在病灶、血管、免疫浸润区还是正常组织。

当研究问题涉及空间来源时，应结合免疫组化、免疫荧光或组织流式。

4、ELISA结果依赖标准曲线和样本基质

样本浓度必须落在标准曲线有效范围内。

浓度过高需要稀释，过低则可能接近检测下限。

血清、血浆、组织匀浆和培养上清具有不同基质，某些成分会干扰抗体结合和显色。不同样本类型不能随意使用同一稀释倍数或处理方法。

5、ELISA不能提供蛋白分子量

ELISA依赖抗体对目标抗原的识别。

即使获得了明确浓度，也无法判断检测的是完整蛋白、裂解片段、聚合物还是具有相同表位的其他形式。

当蛋白加工状态具有研究意义时，需要增加WB或其他验证。

1、免疫组化将蛋白表达放回病理结构中

同样是目标蛋白升高，发生在不同位置可能代表完全不同的机制。

肾脏中的目标蛋白位于肾小球、肾小管或间质，具有不同意义；肿瘤中的信号位于癌细胞、间质、血管或浸润免疫细胞，也会导向不同结论。

免疫组化能够把分子表达和组织病理连接起来。

2、阳性面积和表达强度需要结合细胞数量解释

某个组织区域免疫组化阳性面积增加，可能来自单个细胞表达增强，也可能来自阳性细胞数量增加。

例如，巨噬细胞标志物阳性面积升高，可能说明巨噬细胞浸润增加；并不能直接说明每个巨噬细胞中的目标蛋白表达更高。

研究中应区分细胞数量、阳性比例和单细胞强度。

3、免疫组化适合大范围组织扫描

明场切片易于保存，也适合对整个病灶进行扫描和病理评分。

在大样本组织研究中，免疫组化通常具有较好的实用性。

如果需要同时观察多个细胞标志物和亚细胞定位，普通单标免疫组化的能力相对有限。

4、取景必须采用预设规则

只选择染色最典型的区域，会高估组间差异。

正式分析应提前确定取材层面、视野数量、随机或系统取景方式、盲法和分析参数。

肿瘤边缘、中心、坏死区和间质可能存在明显差异，不能用一个“代表性视野”代替整个样本。

1、免疫荧光更适合多标记和共定位

通过不同颜色的荧光染料，可以同时观察多个蛋白。

例如，将目标蛋白与CD31共染，可以判断其是否位于血管内皮；与F4/80或CD68共染，可以分析其是否来自巨噬细胞；与细胞器标志物共染，可以观察亚细胞定位。

普通免疫组化更适合单标大范围组织表达，免疫荧光更适合多标空间关系。

2、免疫荧光可以观察亚细胞定位

研究NF-κB、YAP、β-catenin等蛋白时，核转位本身可能比总表达更重要。

免疫荧光可以同时标记细胞核和目标蛋白，计算核内与胞质信号。

WB也可以通过核质分离检测核转位，但免疫荧光能够保留单细胞和空间信息。

3、荧光重叠不等于两个蛋白直接结合

两个信号在显微镜下重叠，只能说明它们位于光学分辨率允许的相近区域。

这无法直接证明两个蛋白发生物理结合。

研究蛋白互作时，还需要Co-IP、PLA、FRET或其他适合的技术进行验证。

4、免疫荧光更容易受到自发荧光和曝光影响

组织中的脂褐素、红细胞、胶原和部分固定剂会产生自发荧光。

不同视野若使用不同激光功率、增益和曝光时间，荧光强度将失去直接比较意义。

正式定量时应统一成像参数，并保证信号没有饱和。

5、共聚焦不能自动解决所有定位问题

共聚焦可以减少离焦信号，提高轴向分辨率，但仍存在光学分辨率限制。

判断膜定位、细胞器接触或蛋白共定位时，需要结合三维重建、线扫描、定量系数及功能实验，避免只凭一张叠加图得出机制结论。

1、流式细胞术的核心是“先分群，再检测”

例如，检测肿瘤组织中的PD-1时，可以先选择活的单细胞，再选择CD45⁺免疫细胞、CD3⁺T细胞和CD8⁺T细胞，最后分析CD8⁺T细胞中的PD-1阳性比例和MFI。

这样得到的结果具有明确细胞来源。

全组织WB只能告诉研究者肿瘤组织中的PD-1总信号变化，无法确认具体来自哪一类细胞。

2、比例和绝对数量需要同时考虑

某类细胞比例升高，不代表细胞总数一定增加。

假设其他细胞大量减少，即使目标细胞绝对数量不变，其比例也可能上升。

组织免疫研究中，建议在条件允许时加入计数微球、组织重量归一化或总细胞数记录，计算绝对细胞数量。

3、MFI与阳性率表达不同问题

阳性率反映有多少细胞超过设定门限。

MFI反映所选细胞群体的平均荧光强度，可以作为单细胞表达水平的近似指标。

某个分子可能表现为阳性细胞数量增加，也可能表现为原有阳性细胞表达增强。

两者的生物学意义不同。

4、组织消化可能改变细胞比例和表面抗原

组织流式需要进行机械和酶消化。

某些细胞更容易在消化过程中死亡，某些表面蛋白会被消化酶切割，部分细胞可能因过滤和离心丢失。

因此，流式结果反映的是成功制备并进入检测体系的细胞，不一定完全等同于组织中的原始组成。

消化酶种类、浓度、时间和温度需要根据组织和标志物优化。

5、流式细胞术失去了细胞原来的位置

流式可以证明某类细胞数量和表型发生变化，但无法说明这些细胞位于病灶中心、血管周围、侵袭边缘还是正常组织区域。

当细胞空间位置具有机制意义时，应结合免疫荧光、免疫组化或其他组织成像。

1、检测对象不同

PCR检测mRNA，其他几种方法主要检测蛋白。

mRNA与蛋白之间存在转录后和翻译后调控，因此结果不一定同步。

2、样本来源不同

血清ELISA检测循环中的可溶性蛋白，组织WB检测组织总蛋白，免疫组化观察局部组织表达，流式分析特定细胞中的蛋白。

这些结果分别代表不同生物学区室。

3、统计单位不同

WB和组织匀浆ELISA通常以整个样本为单位。

流式以单个细胞为单位，再汇总细胞群体结果。

免疫组化和免疫荧光则可以以组织面积、细胞数量、单细胞强度或特定区域为单位。

不同分母可能导致看似矛盾的结论。

4、细胞组成变化会影响整体结果

假设病变组织中目标蛋白主要由巨噬细胞表达。

干预后每个巨噬细胞的目标蛋白表达下降，但巨噬细胞数量明显增加。

组织WB可能显示总蛋白不变，流式却显示单个巨噬细胞MFI下降，免疫组化则显示阳性面积增加。

三种结果可以同时成立。

5、分泌和胞内储存可能方向相反

刺激后，细胞可能将胞内细胞因子快速释放到上清中。

此时，上清ELISA升高，细胞裂解液WB却可能没有升高甚至下降。

检测分泌因子时，需要同时考虑胞内合成、储存、分泌和降解。

6、检测时间点不同会造成结果错位

mRNA通常可能先发生变化，随后蛋白表达才逐渐改变；磷酸化可能在数分钟内达到高峰，数小时后已经恢复；分泌蛋白需要一定时间积累到培养上清或血液中。

如果PCR、WB和ELISA使用不同时间点，结果自然可能不一致。

1、分泌因子

研究细胞因子和分泌蛋白时，可采用PCR检测转录，ELISA检测培养上清或血液中的分泌量，流式胞内染色判断由哪类细胞产生，免疫组化或免疫荧光观察其在组织中的来源与分布。

只检测mRNA，无法确认蛋白是否真正分泌；只检测上清ELISA，又无法确认来源细胞。

2、膜蛋白

流式细胞术适合定量特定细胞表面的膜蛋白，免疫荧光适合观察膜定位，WB可以检测总蛋白和膜蛋白分离组分。

组织免疫组化可以观察膜蛋白在病理组织中的表达区域，但普通组织染色的定量能力通常弱于流式。

研究膜蛋白内吞或膜转位时，需要区分表面蛋白与全细胞总蛋白。

3、磷酸化蛋白

WB适合检测总蛋白和磷酸化蛋白的相对变化。

磷酸化流式可以分析不同细胞亚群中的信号激活，适合免疫细胞和混合细胞体系。

免疫组化和免疫荧光也可观察磷酸化蛋白的空间分布，但样本固定、取材时间和抗体质量尤其重要。

qPCR不能直接检测磷酸化状态。

4、转录因子

PCR可以检测转录因子的mRNA，WB可以检测其总蛋白、磷酸化和核质分布，免疫荧光能够观察单细胞核转位。

如果研究转录因子是否真正调控目标基因，还需要结合启动子报告、ChIP-qPCR、基因干预和功能回补等实验。

检测核转位只能说明转录因子可能被激活，不能独立证明它直接调控某个目标基因。

5、细胞亚群标志物

研究免疫细胞比例和表型时，流式细胞术通常优先。

免疫荧光和免疫组化用于补充组织空间和细胞邻近关系。

全组织WB检测CD4、CD8、F4/80或CD68等标志物，容易受到细胞数量和单细胞表达变化双重影响，通常不适合单独用来定义细胞浸润比例。

1、细胞培养样本

细胞可分别用于RNA提取、蛋白裂解、流式检测和免疫荧光。

培养上清可用于ELISA。

需要在实验前计算细胞数量和培养孔数，避免同一孔细胞既用于RNA又用于蛋白，最后样本不足。

2、动物血液

血清或血浆适合ELISA及相关生化检测。

血液细胞可用于流式细胞术。

血清和血浆不能随意混用，抗凝剂和凝血过程会影响部分检测结果。

3、动物组织

一部分新鲜或冻存组织可用于RNA提取和WB。

一部分固定组织用于免疫组化和免疫荧光。

另一部分新鲜组织可消化为单细胞悬液，用于流式细胞术。

不同技术对样本保存条件要求不同。已经经过甲醛固定的组织不能再直接用于常规RNA、蛋白和活细胞流式检测。

4、组织取材需要提前规划

例如，一个小鼠肿瘤样本同时需要：

一部分液氮速冻用于WB和PCR；

一部分固定用于病理、免疫组化和免疫荧光；

一部分放入组织保存液或培养基，立即进行流式消化；

必要时另取一部分制备组织匀浆用于ELISA。

如果动物处死后才决定样本用途，很容易出现组织全部固定、全部冻存或流式样本放置过久的问题。

5、样本分配应围绕主要研究问题

样本有限时，不应平均分配给所有技术。

需要先保证主要终点和关键机制检测，再安排支持性实验。

例如，课题核心是免疫细胞亚群变化，应优先保证新鲜组织流式和空间染色；核心是蛋白磷酸化，应优先完成快速取材和蛋白冻存。

1、第一层：确认目标分子在哪个层面发生变化

可以使用PCR判断转录是否变化，使用WB确认蛋白总量、磷酸化或裂解状态。

如果mRNA和蛋白变化不一致，需要进一步分析蛋白稳定性、翻译效率和时间差异。

2、第二层：确认变化发生在哪一类细胞

组织流式可以判断目标分子在不同细胞亚群中的表达比例和强度。

免疫荧光可通过共染验证目标蛋白与细胞标志物的空间对应。

这一步能够避免用全组织平均结果解释特定细胞机制。

3、第三层：确认变化发生在什么位置

免疫组化和免疫荧光可以判断目标分子位于病灶、血管、炎症区域、纤维化区域还是其他组织结构。

研究亚细胞定位时，优先使用免疫荧光，并结合核质分离或膜蛋白分离WB交叉验证。

4、第四层：确认目标分子是否真正释放或进入体液

对于分泌蛋白，需要使用ELISA检测培养上清、血清、血浆或其他体液中的浓度。

胞内蛋白升高不代表分泌增加，上清浓度变化也不能单独证明转录和合成增强。

5、第五层：通过干预证明因果关系

检测方法只能描述变化。

要证明目标分子推动疾病或细胞表型，需要进行基因敲低、过表达、药理抑制、抗体阻断及功能回补。

干预后应同时观察分子变化和功能终点，形成“目标分子—细胞过程—疾病表型”的完整链条。

6、六种技术不需要在每个课题中全部使用

例如，研究细胞内蛋白磷酸化通路，PCR价值可能相对有限；研究血清抗体浓度，ELISA可能是核心方法；研究免疫细胞亚群，流式和空间染色更重要。

实验设计应根据问题选择技术，而不是根据可提供的技术反向拼接研究问题。

1、用PCR结果直接说明蛋白被激活

mRNA升高只能说明转录层面发生变化。

2、把WB总蛋白变化写成特定细胞中的变化

全组织裂解液缺少细胞来源信息。

3、用WB检测细胞比例

免疫细胞标志物条带增加，可能来自细胞数量或单细胞表达变化，无法直接换算细胞比例。

4、用ELISA证明分泌来源

血清或上清浓度不能直接说明由哪一类细胞产生。

5、免疫组化只挑选最典型视野

选择性取景会放大组间差异。

6、免疫荧光信号重叠就定义蛋白互作

光学共定位无法替代直接互作验证。

7、不同组使用不同曝光参数

荧光强度失去定量可比性。

8、流式只报告比例，不报告绝对数量

细胞比例变化可能由其他群体改变造成。

9、流式忽略单细胞、死细胞和补偿控制

双联体、死细胞自发荧光和通道串色会造成假阳性。

10、用一次流式门控处理所有批次

不同批次样本背景和仪器状态可能不同，但门控原则应统一，不能为了获得预期结果随意移动门限。

11、PCR和WB使用不同批次样本，却直接讨论上下游关系

样本来源和处理条件不一致会增加解释风险。

12、ELISA样本超出标准曲线仍直接计算

超范围数据需要重新稀释检测。

13、忽略免疫组化和免疫荧光抗体的物种与应用验证

适用于WB的抗体不一定适用于固定组织染色或流式细胞术。

14、为了结果“完整”机械加入所有技术

大量重复性数据可能增加成本，却没有增加机制深度。

第一步，先明确检测对象。

目标是DNA、RNA、蛋白、分泌因子、细胞亚群还是组织空间。

第二步，明确需要相对表达还是绝对浓度。

PCR和WB更常用于相对表达，ELISA更适合在标准曲线范围内进行浓度定量。

第三步，明确是否需要细胞来源。

需要区分不同细胞亚群时，优先考虑流式细胞术或免疫荧光共染。

第四步，明确是否需要保留组织结构。

需要观察病灶、血管、肾小球、肿瘤边缘或其他空间结构时，使用免疫组化或免疫荧光。

第五步，明确是否研究蛋白加工或修饰。

磷酸化、剪切和分子量变化通常优先采用WB；不同细胞亚群中的磷酸化状态可结合磷酸化流式。

第六步，明确是否研究亚细胞定位。

核转位、膜转位和细胞器定位可采用免疫荧光，并结合亚细胞分离WB进行交叉验证。

第七步，明确样本能否满足技术要求。

流式需要新鲜单细胞悬液，PCR和WB需要合理保存的组织或细胞，免疫组化和免疫荧光需要固定切片，ELISA需要适合的液体或匀浆样本。

第八步，为每一种技术安排不同任务。

PCR回答转录，WB回答蛋白与修饰，ELISA回答分泌浓度，免疫组化回答组织病理位置，免疫荧光回答细胞与亚细胞空间，流式回答单细胞亚群与比例。

第九步，使用功能实验完成最终验证。

检测结果需要与增殖、死亡、迁移、屏障、吞噬、免疫杀伤、代谢和器官功能等课题相关终点结合，才能形成机制结论。

WB、ELISA、PCR、免疫组化、免疫荧光和流式细胞术之间没有简单的替代关系。

科研项目的难点通常在于，怎样根据研究问题安排检测层级，并在样本有限的情况下形成相互支持的证据链。

博恩生物可围绕基础科研课题提供细胞实验、动物模型、样本取材、分子检测、病理成像、流式细胞术和机制验证等实验支持。

在PCR检测方面，可根据课题方向开展RNA提取、逆转录、RT-qPCR、引物设计和相对表达分析，并根据实验条件评估内参基因及样本质量。

在WB检测方面，可开展总蛋白、磷酸化蛋白、蛋白裂解、核质分离、膜蛋白及相关信号通路检测，并根据目标蛋白分子量、表达丰度和抗体情况优化实验条件。

在ELISA检测方面，可开展细胞培养上清、血清、血浆、尿液和组织匀浆中的细胞因子、激素、抗体及其他可溶性指标检测，并结合标准曲线、稀释倍数和样本基质进行质量控制。

在免疫组化和免疫荧光方面，可开展组织定位、阳性面积、表达强度、多标共染、细胞来源和亚细胞定位分析，并根据组织结构设计取景、盲法和定量规则。

在流式细胞术方面，可根据研究目的设计多参数抗体面板，开展免疫细胞分型、细胞表面和胞内分子、细胞周期、凋亡、增殖、细胞因子及磷酸化信号检测，并结合绝对计数和合理门控进行分析。

在实验方案设计方面，可根据课题假设确定哪些方法承担核心证据、哪些方法用于交叉验证，并提前规划细胞、培养上清、血液和组织样本的取材、保存及分配。

对于已有部分结果的科研项目，博恩生物可先梳理现有数据处于转录、蛋白、空间、细胞来源还是功能层面，再判断下一步更适合补充WB、ELISA、PCR、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术或功能实验，避免重复检测和样本浪费。

方案设计与后续实验实施同步推进，不单独收取方案设计费用。项目可以按照前期验证、机制补充和动物实验分阶段开展，实验数据和研究成果归属委托方。

WB、ELISA、PCR、免疫组化、免疫荧光和流式细胞术的差别，最终可以归纳为六个不同问题：

PCR回答目标基因有没有发生转录变化；

WB回答目标蛋白、分子量和修饰状态有没有变化；

ELISA回答液体样本中目标分子的浓度是多少；

免疫组化回答目标蛋白位于哪一个组织和病理区域；

免疫荧光回答目标蛋白位于哪一类细胞和哪个亚细胞位置；

流式细胞术回答哪些细胞发生了变化、变化细胞占多少，以及单个细胞表达强度如何。

一项研究不需要为了“完整”而把六种技术全部做一遍。

更合理的设计，是先明确科学问题，再让每一种技术承担它最擅长回答的部分。

当转录、蛋白、分泌、空间、细胞来源和功能结局能够彼此衔接时，多技术组合才会形成真正有解释力的证据链。