尤文肉瘤动物实验研究用户指南

导读

一、指南总览
二、尤文肉瘤细胞系库与融合基因特征
三、皮下异种移植模型（CDX）
四、骨原位模型
五、转移模型
六、人源化免疫尤文肉瘤模型
七、放疗联合、术后复发与特殊场景模型
八、项目升级路径建议
九、检测指标与阳性药体系
十、优势与局限

一、指南总览

尤文肉瘤动物模型的选择，不能只按照皮下、原位和转移等技术类型进行划分，更应围绕研发问题进行分层。对于尤文肉瘤项目，早期药效评价与剂量探索通常优先采用皮下异种移植模型；当研究重点转向骨微环境、局部侵袭、骨破坏、骨髓腔扩展以及术后复发时，应进一步采用骨原位模型；当需要评价肺转移、骨外播散以及复发转移抑制效果时，应进入相应的转移模型；当研究对象涉及免疫治疗、TCE、CAR-T/NK、巨噬细胞重塑或细胞因子时，则应优先考虑同种免疫完整模型、工程化免疫模型或人源化免疫模型。

尤文肉瘤的建模逻辑，本质上是围绕融合基因背景、骨场景、转移场景和免疫场景进行组合选型。与常见的上皮来源实体瘤相比，尤文肉瘤的核心特征更集中于分子驱动、骨微环境依赖性以及肺转移倾向。因此，一份真正具有使用价值的尤文肉瘤动物模型指南，不应停留在细胞系罗列层面，而应帮助项目团队明确当前最关键的问题应由哪一类模型来回答。

尤文肉瘤项目通常可以归纳为四类需求。第一类是常规细胞毒药、小分子药物、ADC 及纳米药物的早期药效筛选，这类项目更强调成瘤稳定性、给药窗口以及 PK/PD 的可操作性。第二类是骨内生长、骨破坏、局部递药和放疗联合项目，这类项目更重视骨原位环境及肿瘤侵袭路径。第三类是肺转移、术后复发和微小残留病灶项目，这类项目更依赖原位切除后的长期追踪。第四类是融合基因相关靶向、免疫治疗和细胞治疗项目，这类项目更依赖机制终点、免疫背景或人免疫系统重建。后续模型选择应始终围绕这四类问题展开。

二、尤文肉瘤细胞系库与融合基因特征

2.1 EWSR1::FLI1 代表性细胞系

尤文肉瘤最常见的分子驱动事件是 EWSR1::FLI1 融合，因此相关细胞系仍然是体内研究的核心平台。常用代表性细胞系包括 A673、TC-71、RDES 和 EW8。其中，A673 是最常见的早期药效与机制研究平台之一，适合用于皮下药效、骨原位、肺转移衍生和融合基因相关通路研究。TC-71 属于经典且稳定性较高的平台，适合用于皮下、原位和转移研究。RDES 与 EW8 则常用于补充不同生长速度、不同侵袭表型和不同药物响应背景。若项目重点关注 EWSR1::FLI1 依赖性、转录调控、表观遗传靶点、DNA 损伤修复或细胞周期抑制，应优先从这类细胞系中进行选择。

2.2 其他常用尤文肉瘤细胞系

除 A673、TC-71、RDES 和 EW8 外，SK-ES-1 也是较常用的尤文肉瘤研究平台，适合用于转移、生长侵袭和药物筛选研究。不同细胞系在成瘤速度、坏死比例、肺转移倾向、融合转录本表达强度以及培养稳定性方面存在明显差异，因此不建议仅使用单一细胞系代表全部尤文肉瘤项目。对于需要进行候选药排序并提升外推稳健性的项目，建议至少采用两到三个不同背景的细胞系并行验证。

2.3 荧光素酶（luc）标记与衍生高转移株

在尤文肉瘤动物研究中，荧光素酶标记株的价值通常高于单纯依赖肿瘤体积测量的平台。对于骨原位、肺转移、术后复发和微小残留病灶项目，建议优先建立 A673-luc、TC-71-luc、RDES-luc 或 EW8-luc 等可追踪平台。若项目重点放在肺转移或长期复发，建议进一步建立肺转移富集衍生株或长期原位筛选株，以提高转移模型的稳定性和检出率。

2.4 细胞系选择原则

尤文肉瘤项目中的细胞系选择，应优先围绕融合基因状态、骨原位适配性、转移潜能、目标抗原表达稳定性以及项目所需终点展开。若项目偏重早期药效和剂量探索，应优先选择成瘤稳定、批间一致性较好的 A673、TC-71、RDES 或 EW8。若项目偏重骨破坏、局部侵袭和转移，应优先考虑带有荧光素酶标记并具备原位或肺转移研究经验的模型。若项目涉及融合蛋白下游通路、表观遗传调控或转录复合体抑制，则应优先确认融合状态、STR 身份和关键通路依赖性，而不应仅按“是否常用”来选株。

三、皮下异种移植模型（CDX）

皮下 CDX 是尤文肉瘤最稳健的早期药效平台，适用于概念验证、剂量探索、PK/PD 关联以及不同候选药之间的横向排序。该模型的优势在于成瘤率高、操作标准化、成本相对较低且批间一致性好；其局限在于无法真实反映骨微环境、骨髓腔压力、局部骨破坏、肺转移过程以及术后复发，因此不宜单独用于判断抗转移、抗骨破坏或免疫治疗项目的成败。

3.1 A673 皮下 CDX

A673 皮下 CDX 通常在 BALB/c nude、NOD-SCID、NSG 或 NOG 小鼠中建立，可采用 1×10^6 至 5×10^6 个人源细胞进行皮下接种，也可接种 20 至 40 mm3 的肿瘤块，在肿瘤体积达到约 80 至 150 mm3 后进行随机分组。该模型适合用于小分子、细胞毒药、ADC、纳米药物及融合基因相关靶向策略的早期药效筛选。常规治疗周期一般为 2 至 4 周，若研究耐药、撤药再挑战或长期暴露，则可延长至 4 至 8 周。评价终点通常包括 TGI、RTV、终末瘤重和体重，同时还可加入 CD99、Ki67、cleaved caspase-3、融合转录本表达、PARP、DNA 损伤标志物及 PK/PD 等机制终点。阳性药物可参考 VDC/IE 等效化疗、伊立替康/替莫唑胺、拓扑异构酶抑制方向药物以及多靶点 TKI。该模型是尤文肉瘤早期筛选的核心平台之一，适合开展标准化药效评价、剂量探索和载荷排序；若项目目标涉及骨微环境、肺转移或术后复发，则应尽快升级至骨原位或转移模型。

3.2 TC-71 皮下 CDX

TC-71 皮下 CDX 同样可在 BALB/c nude、NOD-SCID、NSG 或 NOG 小鼠中建立，通常采用常规皮下接种方式，在肿瘤达到约 80 至 150 mm3 后入组。该模型适合用于常规细胞毒药、靶向药、ADC 以及联合治疗的早期药效评价。治疗周期多为 2 至 4 周，主要检测指标包括 TGI、RTV、终末瘤重、CD99、Ki67、凋亡指标和融合基因表达。阳性药物可参考 VDC/IE 等效化疗、伊立替康/替莫唑胺和多靶点 TKI。TC-71 的优势在于从皮下到原位再到转移模型的连续升级较为顺畅，适合构建系列化药效验证路径。

3.3 RDES、EW8、SK-ES-1 皮下 CDX

RDES、EW8 和 SK-ES-1 皮下 CDX 多在 BALB/c nude、NOD-SCID 或 NSG 小鼠中建立，通常采用常规皮下接种，在肿瘤达到约 80 至 150 mm3 后入组。此类模型主要用于补充不同生长速度、不同侵袭背景和不同药物敏感性的验证。治疗周期通常为 2 至 4 周，评价指标包括 TGI、RTV、终末瘤重、CD99、Ki67、凋亡和细胞周期相关指标。阳性药物可参考细胞毒药、伊立替康/替莫唑胺和多靶点 TKI。这类模型更适合在候选药确认阶段提高结果稳健性，不建议依赖单一细胞株完成全部决策。

3.4 皮下模型总体原则

皮下模型适合用于剂量探索以及靶向药、ADC 和小分子药物的早期筛选。若研究目标涉及转移、局部递药、骨微环境、肺转移、术后复发或 BBB 相关暴露，则应尽快升级至原位或转移模型。对于尤文肉瘤而言，皮下缩瘤结果并不能直接代表骨内控瘤能力或抗肺转移能力，因此不宜将其作为进入临床前确认阶段的唯一依据。

四、骨原位模型

骨原位模型是尤文肉瘤动物实验中最接近真实疾病场景的基础平台。与皮下模型相比，胫骨内、股骨内或邻骨原位模型能够更真实地呈现骨髓腔环境、骨皮质破坏、骨膜反应、局部疼痛以及向肺转移发展的前端过程，因此在抗骨破坏、局部侵袭、局部递药、放疗联合和术后复发研究中优先级更高。该模型的局限在于操作门槛较高、通量较低、需要影像学配合，且批间差异相对更大。

4.1 A673 骨原位模型

A673 骨原位模型通常采用 A673-luc 或 A673 细胞，在 NOD-SCID、NSG 或 NOG 小鼠中通过胫骨内或股骨内注射建立。该模型适合研究骨内生长、骨破坏、局部侵袭、原位切除后复发以及肺转移的前端过程。为便于连续追踪，建议优先使用荧光素酶标记株，并结合 X 线、micro-CT 或 BLI 进行动态观察。常规治疗周期为 3 至 6 周，若研究术后复发或长期抗转移，则可延长至 6 至 10 周。主要评价终点包括原位肿瘤负荷、BLI、骨破坏评分、micro-CT、病理、肺转移情况和生存。若项目核心问题集中在骨微环境、局部侵袭和肺转移，A673 骨原位模型的优先级明显高于皮下模型。

4.2 TC-71 骨原位模型

TC-71 骨原位模型通常采用 TC-71-luc 或 TC-71 细胞，在 NOD-SCID、NSG 或 NOG 小鼠中建立，适用于骨原位控瘤、骨破坏、放疗联合以及转移研究。与 A673 相比，TC-71 更常被用于从标准药效研究延伸至原位和转移验证，因此非常适合搭建较为连续的研发路径。对于希望将皮下早筛结果直接升级至骨场景验证的项目，TC-71 是实用性较高的平台。

4.3 RDES、EW8 骨原位模型

RDES-luc 和 EW8-luc 骨原位模型通常在 NOD-SCID 或 NSG 小鼠中建立，主要用于补充不同侵袭性和不同治疗反应背景下的骨原位验证。此类模型有助于在候选药确认阶段增加模型多样性，并观察不同背景下的骨破坏、局部侵袭和肺转移表现。对于稳健性要求较高，或前期结果呈现明显细胞系依赖性差异的项目，建议纳入此类模型。

4.4 骨原位模型总体原则

骨原位模型应优先用于回答皮下模型难以充分解释的问题，包括骨内暴露、骨髓腔渗透、骨破坏、放疗增敏、原发灶切除后复发以及肺转移抑制。若项目的核心问题在于药物能否在真实骨环境中保持活性，则骨原位模型的优先级应显著高于皮下模型。

五、转移模型

尤文肉瘤转移模型主要用于回答三个关键问题，即药物是否能够抑制肺转移定植、是否能够在远处器官微环境中保持活性，以及在原发灶得到控制后是否仍能降低复发与转移风险。对尤文肉瘤而言，肺转移模型的优先级最高，其次是骨外播散、局部复发和微小残留病灶场景。

5.1 肺转移模型

肺转移模型常用细胞包括 A673-luc、TC-71-luc 和 SK-ES-1-luc，适用于抗转移、抗定植、术后复发和循环后定植过程研究。实验性肺转移多采用尾静脉注射，若研究需要更接近临床转移链路，则更推荐在骨原位建模后观察自发肺转移，或在原发灶达到一定负荷后手术切除并继续追踪肺转移。尾静脉模型的优点是重复性较高、周期较短，但主要反映循环后定植阶段；骨原位自发肺转移模型更贴近临床全过程。实验性肺转移模型的治疗周期通常为 2 至 6 周，自发肺转移模型的总周期通常为 4 至 10 周。主要检测指标包括 BLI、肺结节数、肺重、组织病理和生存。对于尤文肉瘤项目，肺转移研究更适合优先采用骨原位自发转移路径，而不宜仅用尾静脉模型替代全部转移外推。

5.2 术后复发与微小残留病灶模型

术后复发与微小残留病灶模型常用 A673-luc 和 TC-71-luc 细胞，适合围手术期治疗、抗复发、微小残留病灶清除以及肺转移抑制研究。该模型通常在骨原位建模后，于原发灶达到一定负荷时进行截肢或局部切除，随后观察局部复发、肺转移和生存情况。该模型更接近临床中“局部控制后远处复发”的关键问题，因此在尤文肉瘤转化研究中具有较高价值。主要检测指标包括复发时间、肺转移负荷、BLI、生存和病理。若项目聚焦复发难治或围手术期干预，应优先考虑该模型，而不宜仅依赖皮下或单纯尾静脉模型。

5.3 其他播散模型

其他播散模型常用 TC-71、SK-ES-1 及 RDES 衍生株，可用于研究骨外播散、晚期多器官负荷和系统性治疗反应。建模方式包括左心室注射、静脉注射或特殊器官接种。这类模型适合研究多器官定植及系统暴露，但其临床链路外推性通常低于骨原位自发转移模型，因此更适合回答特定器官定植问题，不宜替代标准骨原位路径。

六、人源化免疫尤文肉瘤模型

人源化模型适合回答普通 CDX、PDX 和工程化同种模型难以充分解释的问题，尤其适用于 TCE、CAR-T/NK、人源细胞因子、检查点联合以及强依赖人免疫效应的 ADC 或双抗项目。这类模型的重点不在于通量，而在于关键节点验证。

6.1 huPBMC + 人源尤文肉瘤细胞模型

huPBMC + 人源尤文肉瘤细胞模型适用于短周期免疫治疗筛选，常用细胞包括 A673、TC-71、RDES、EW8 和 SK-ES-1。该模型建模速度较快，通常在 2 至 4 周内即可进入实验阶段，适合开展短期免疫治疗、TCE 以及 CAR-T/NK 研究。其主要局限在于 xGvHD 风险较高、治疗窗口较短，更适合短程读数，而不适合长期机制研究。评价终点通常包括肿瘤负荷、人免疫细胞重建率、hCD45、hCD3、hCD8、hNK、细胞因子以及 CRS 和 xGvHD 风险指标。

6.2 huHSC + 人源尤文肉瘤模型

huHSC + 人源尤文肉瘤模型适用于长周期人免疫系统重建、复杂免疫机制研究和联合策略验证。该模型的免疫重建更稳定，适合较长周期的免疫治疗、耐药和复发研究，但准备周期较长、成本较高，且供者差异较为明显。该模型更适用于候选药确认阶段，或需要解释复杂人免疫机制时使用。

七、放疗联合、术后复发与特殊场景模型

当尤文肉瘤项目涉及放疗增敏、围手术期干预、术后复发、微小残留病灶或骨痛控制时，单纯依赖皮下模型通常难以充分支持决策。更适合的策略是采用骨原位或术后复发模型，在原发灶达到一定负荷后实施放疗、切除或药物干预，随后观察局部复发、肺转移和生存变化。

这类模型尤其适合评价放疗增敏剂、围手术期免疫治疗、局部制剂、抗复发药物以及微小残留病灶清除策略。若项目关注的是初始缩瘤有效但复发抑制不足的情形，这类模型的价值通常明显高于单纯的早期皮下模型。

八、项目升级路径建议

8.1 小分子、细胞毒药与 ADC 项目

对于小分子、细胞毒药与 ADC 项目，建议采用“皮下 CDX 早筛—骨原位模型验证骨微环境与药物分布—必要时加入肺转移或术后复发模型”的递进路径。若项目聚焦载荷、DNA 损伤类药物、转录调控抑制剂或多靶点 TKI，应优先确认体内机制终点，而不宜只观察体积变化。

8.2 融合基因相关靶向项目

对于融合基因相关靶向项目，建议采用“皮下 CDX 进行早期排序—骨原位模型验证真实骨环境活性—PDX 或多细胞系平台确认稳健性”的路径。若项目针对 EWSR1::FLI1 相关通路抑制或表观遗传调控药物，建议至少设置一个皮下模型和一个骨原位模型，以避免高估皮下缩瘤结果对骨场景的外推价值。

8.3 转移与复发抑制项目

对于转移与复发抑制项目，建议采用“骨原位模型建立原发灶—观察或切除后追踪肺转移—必要时增加实验性肺转移模型以拆分定植阶段”的路径。若项目定位为抗转移策略，应优先使用荧光素酶标记株，并尽量将 BLI、生存和器官病理纳入核心终点。

8.4 免疫治疗项目

对于免疫治疗项目，建议采用“工程化同种模型或短周期人免疫效应模型早筛—人源化模型验证—必要时加入原位或术后复发场景”的路径。此类项目不建议仅在普通免疫缺陷皮下 CDX 中判断成败，因为这类模型难以真实反映免疫浸润、细胞毒性和微环境重塑。

九、检测指标与阳性药体系

9.1 通用检测指标

不同模型的核心检测指标应根据研究目标进行配置。皮下模型的核心终点通常包括 TGI、RTV、终末瘤重和体重。骨原位模型的核心终点通常包括原位肿瘤负荷、骨破坏评分、micro-CT、BLI 和生存。肺转移模型的核心终点通常包括 BLI、肺结节数、肺部病理和生存。术后复发模型的核心终点通常包括复发时间、肺转移负荷和生存。免疫模型的机制终点通常包括 CD8、髓系细胞谱、细胞因子和 hCD45 重建率。此外，还可根据项目需要加入 CD99、Ki67、cleaved caspase-3、融合基因表达、ctDNA、转录组以及药代药效关联等机制终点。

9.2 阳性药推荐

阳性药体系应与项目阶段保持一致。一线化疗可参考 VDC/IE 等效化疗框架，复发难治方向可参考伊立替康/替莫唑胺以及拓扑异构酶抑制方向药物，多靶点 TKI 可参考 regorafenib 和 pazopanib，前沿研发方向可参考 lurbinectedin、seclidemstat 和 TK216 等，用作机制性或临床探索性参照。早期药效平台更强调稳健对照和信号强度，因此建议优先使用临床路径清晰、机制明确的标准治疗药物；对于融合蛋白相关靶向、表观遗传药物以及复发难治方向，可在标准治疗基础上增加前沿机制药物作为参考，而不宜仅使用单一细胞毒药构建对照体系。

十、优势与局限

皮下 CDX 的优势在于标准化程度高、重复性好，适合早期筛选和 PK/PD 研究；其局限在于缺乏骨微环境、真实骨破坏路径和肺转移链路。骨原位模型更接近临床骨内环境，适合用于骨破坏、局部侵袭、术后复发和自发性肺转移研究；其不足在于操作复杂、通量较低且批间差异较大。实验性转移模型的优势在于周期较短、读数集中，适合回答器官定植问题；其局限在于难以完整反映自然转移全过程。PDX 模型的优势在于能够保留患者来源肿瘤的异质性，具有更强的转化意义；其局限在于成本较高、周期较长、通量较低。人源化与免疫相关模型的优势在于可以评价人免疫依赖机制；其局限在于成本高、噪声大，并存在明显的供者差异和 xGvHD 风险。

尤文肉瘤动物模型研究的关键，在于当前研发问题是否由合适的模型回答。对于早期药效项目，应优先保证皮下平台的稳定性与 PK/PD 可解释性；对于骨破坏、局部侵袭和肺转移项目，应尽快进入骨原位场景；对于复发难治和免疫项目，则应将术后复发、人源化或工程化免疫平台放在更高优先级。整体上，建议采用“皮下早筛—骨原位验证—转移深化—复发补强—免疫确认”的递进式路径，以提高模型结果对临床开发的支持价值。