骨肉瘤动物实验研究用户指南

导读

一、指南总览
二、骨肉瘤细胞系与疾病特征
三、皮下异种移植模型（CDX）
四、骨内原位模型
五、转移模型
六、同种免疫完整模型
七、人源化免疫骨肉瘤模型
八、术后复发与微小残留病灶模型
九、项目升级路径建议
十、检测指标与阳性药体系
十一、优势与局限

一、指南总览

骨肉瘤动物模型的选择，不能仅按皮下、原位、转移等技术类型进行划分，更需要围绕研发问题、骨内微环境、肺转移风险、术后复发以及免疫场景进行分层。对于骨肉瘤项目，早期药效与剂量探索通常优先采用皮下异种移植模型；当研究重点转向骨内生长、皮质骨破坏、骨痛、局部侵袭和局部递药时，应进一步采用骨内原位模型；当需要评估肺转移、围手术期治疗和微小残留病灶时，则应进入相应的转移或复发模型；对于免疫治疗、细胞治疗、细胞因子、抗血管生成联合以及复杂肿瘤微环境机制的研究，同种免疫完整模型通常更具优先级。整体来看，骨肉瘤建模的核心逻辑，是将病理生物学特征、骨微环境以及肺转移场景进行组合匹配。

不同研究方向对模型策略的要求差异明显。常规骨肉瘤药效项目更关注 MAP 化疗框架下新药是否带来额外获益；高转移项目更强调肺定植、骨内原发灶控制与远处播散之间的联动关系；DDR 或合成致死方向更关注 BRCA-like 特征、ATR/PARP 联合及 DNA 损伤标志物；GD2、B7-H3 等免疫或细胞治疗项目则更强调靶点表达稳定性、免疫完整背景和原位环境。因此，一份真正具有实用价值的骨肉瘤动物模型指南，应帮助项目团队明确当前最关键的问题应由哪一类模型来回答，从而提高模型选择与研发决策的匹配度。

二、骨肉瘤细胞系与疾病特征

2.1 通用代表性细胞系

骨肉瘤研究中常用的人源细胞系包括 143B、HOS-MNNG、SJSA-1、U2OS、SaOS-2 和 MG-63。143B 与 HOS-MNNG 更适合高侵袭、肺转移和原位研究；SJSA-1 生长较快，适合早期药效筛选；U2OS、SaOS-2 和 MG-63 则更适合作为分化程度相对较高、增殖较稳定或偏机制研究的基础模型。若项目目标是快速建立稳定的药效平台，SJSA-1、U2OS 和 MG-63 通常更适合作为首轮筛选模型；若项目重点在侵袭、骨破坏和肺转移，则 143B 或 HOS-MNNG 更具代表性。

2.2 高转移与高侵袭模型

在高转移骨肉瘤研究中，143B 或 143B-luc 是应用最广的人源模型之一，尤其适合胫骨原位、自发肺转移和术后肺复发研究。HOS-MNNG 也常用于高转移和局部侵袭方向。鼠源同种模型中，K7M2 或 K7M2-luc 以及 LM8 是经典的高肺转移平台，前者多用于 BALB/c 背景，后者多用于 C3H/He 背景。若项目核心问题与抗转移、围手术期治疗或肺转移抑制密切相关，应在建模初始阶段就优先考虑这些高转移模型，以确保后续结论具有足够的生物学相关性。

2.3 DDR、PARP/ATR 与靶向项目的选型逻辑

若项目涉及 DDR、PARP 抑制、ATR 抑制或合成致死方向，应优先选择 DNA 损伤背景清晰、且在体内仍能维持相关应答特征的模型，并在体外、成瘤后及终点阶段持续验证 γH2AX、RAD51、pCHK1、pATR 等检测读数。对这类项目而言，皮下模型适合开展早期通路验证，原位模型和肺转移模型更适合评估该机制在高侵袭和高转移背景下是否仍然成立。若项目聚焦 B7-H3、GD2 等免疫靶向方向，则需要同步考察靶点表达、肺转移场景和免疫背景，避免仅依据肿瘤体积抑制作出判断。

2.4 同种与免疫完整模型代表株

在同种免疫完整平台中，K7M2 或 K7M2-luc、LM8 和 MOS-J 是最常用的代表模型。K7M2 是 BALB/c 背景下经典的高肺转移骨肉瘤模型，适合用于免疫治疗、局部治疗、抗转移以及围手术期方案设计；LM8 在 C3H/He 背景下常用于高肺转移和术后复发研究。对于骨肉瘤而言，同种原位模型通常较同种皮下模型更具研究价值，因为骨内环境、骨代谢以及原发灶到肺转移的连续过程，在原位状态下更接近真实疾病进展。

三、皮下异种移植模型（CDX）

皮下 CDX 是骨肉瘤早期药效研究中最稳健的基础平台，适用于药效验证、剂量探索、PK/PD 关联以及不同候选药物之间的横向排序。该模型成瘤率高、操作标准化程度较好、批间一致性较强，适合完成小分子、细胞毒药、ADC、纳米药物和部分靶向药的首轮排序。其主要局限在于难以真实反映骨内微环境、皮质骨破坏、骨痛、局部复发和肺转移，因此不宜单独用于评价抗转移、骨内递药或围手术期项目的整体成败。

3.1 高转移骨肉瘤皮下 CDX

以 143B、143B-luc 或 HOS-MNNG 联合 BALB/c 裸鼠或 NSG 小鼠建立的皮下 CDX，适合高侵袭骨肉瘤的小分子、细胞毒药、抗转移药物以及早期 PK/PD 研究。常规造模方式为皮下接种人源细胞，待肿瘤体积达到约 80–150 mm³ 后随机分组。143B 常被用作高转移背景下的早期排序平台，后续可进一步升级为胫骨原位模型或自发肺转移模型。治疗周期通常为 2–4 周；若研究目标涉及耐药、停药后再挑战、ADC 多给药间隔覆盖或合成致死策略，可延长至 4–8 周。主要观察终点包括 TGI、RTV、终末瘤重和体重，机制性指标可增加 osteocalcin、Ki67、cleaved caspase-3、γH2AX 以及药物组织分布。阳性药物方面，动物实验中常以多柔比星联合顺铂作为 MAP 化疗框架的简化参考；若项目聚焦抗转移，也可加入 cabozantinib 或多靶点 TKI 作为机制性对照。

3.2 通用骨肉瘤皮下 CDX

以 SJSA-1、U2OS、SaOS-2 或 MG-63 联合 BALB/c 裸鼠或 NSG 小鼠建立的通用骨肉瘤皮下 CDX，更适合常规骨肉瘤药效评估、剂量探索、PK/PD 研究及部分机制研究。通常在皮下接种后，待肿瘤达到约 80–150 mm³ 时入组。SJSA-1 更适合快速形成可测量病灶；U2OS、SaOS-2 和 MG-63 更适合作为分化型及中等侵袭背景下的基础平台。治疗周期多为 2–4 周，若研究长期抑制、耐药形成或联合治疗，可适当延长。核心检测指标包括 TGI、RTV、终末瘤重、Ki67、cleaved caspase-3 以及相关通路抑制指标。阳性药物通常采用多柔比星联合顺铂；若项目偏向 DDR 方向，可加入 PARP/ATR 联合作为机制性参考。

3.3 DDR、B7-H3、GD2 等靶向方向皮下 CDX

对 DDR、B7-H3、GD2、ADC、双抗及细胞治疗项目，可采用 143B、SJSA-1、U2OS 或其他与目标表达更匹配的模型，联合 BALB/c 裸鼠或 NSG 小鼠建立皮下 CDX，用于前期验证。常规方法为皮下接种，肿瘤达到约 80–150 mm³ 后开始治疗。治疗周期一般为 2–4 周；若项目强调持续通路抑制或细胞治疗持久性，可增加中期取材时间点。主要检测指标包括 TGI、RTV、终末瘤重、目标抗原表达、DNA 损伤读数以及药物组织分布。DDR 方向可采用 olaparib 联合 ceralasertib 作为前沿研发参考；B7-H3 方向可将 HS-20093 作为机制性参照；GD2 方向则更适合在后续免疫完整模型或人源化模型中进一步验证。该类模型尤其适用于判断药物是否准确命中靶点，但对于骨内场景和肺转移场景中的真实行为变化，仍需依赖原位模型和转移模型进行补充。

四、骨内原位模型

骨内原位模型是骨肉瘤动物实验中最接近临床器官环境的基础平台。与皮下模型相比，该模型能够更真实地呈现松质骨、皮质骨、骨髓腔、骨代谢以及肿瘤局部血供之间的相互作用，因此在局部侵袭、皮质骨破坏、骨痛、局部复发和围手术期研究中的优先级更高。其主要限制在于操作门槛较高、实验通量较低、批间差异相对较大，同时对骨内注射位置、影像随访以及时间窗一致性的要求更严格。

4.1 人源长骨骨内原位模型

采用 143B-luc、HOS-MNNG、SJSA-1、U2OS 或 SaOS-2 建立的人源长骨骨内原位模型，适合研究骨内微环境、局部侵袭、皮质骨破坏、骨痛及局部递药。常见造模方式为在麻醉条件下，将肿瘤细胞缓慢注入胫骨近端、胫骨远端或股骨远端的骨髓腔，并可在术后结合荧光素酶成像、X 线或 micro-CT 进行基线确认。对于更强调局部病灶稳定性的项目，也可采用骨内植入小肿瘤块，但从标准化角度考虑，细胞悬液注射更适合常规实验。治疗周期通常为 2–6 周；若研究重点在骨破坏、肺转移形成或局部递药持续效应，应适当延长观察时间。检测指标通常包括原位骨肿瘤体积、患肢肿胀、micro-CT、X 线、骨破坏评分、生存、肺转移结节数、ALP 及其他骨代谢指标；免疫组化常用 osteocalcin、Ki67、cleaved caspase-3 和 TRAP。阳性药物多采用 MAP 化疗框架的简化方案，其中多柔比星联合顺铂最常见；若项目聚焦抗转移，也可加入 cabozantinib 或多靶点 TKI 作为机制性对照。

4.2 同种骨内原位模型

K7M2-luc、LM8 或 MOS-J 联合匹配品系小鼠建立的同种骨内原位模型，更适合免疫治疗、局部治疗、肿瘤微环境重塑、放疗联合及转移研究。常规方法为将鼠源骨肉瘤细胞注射至胫骨或股骨骨髓腔，并结合荧光素酶成像、X 线或 micro-CT 进行动态监测。K7M2-luc 在 BALB/c 背景下尤其适合高肺转移研究；LM8 在 C3H/He 背景中常用于原发灶到肺转移的全链条研究。治疗周期通常为 2–5 周；若研究免疫微环境和转移形成，应在原发灶可测或影像阳性后尽早干预，并预留肺转移形成窗口。常用检测指标包括原位骨肿瘤负荷、骨破坏、生存和免疫浸润，机制性终点可增加流式细胞术、单细胞测序、TCR 谱分析及细胞因子检测。阳性药物方面，MAP 化疗简化方案仍可作为基础对照；对于免疫联合项目，可加入抗 PD-1、细胞因子或多靶点 TKI 作为参考。

五、转移模型

骨肉瘤转移模型主要用于回答三个关键问题，即药物是否抑制定植、药物是否能在肺等特定器官微环境中保持活性，以及原发灶控制后是否能够影响远处肺转移复发。对于骨肉瘤而言，肺转移是优先级最高的转移场景，其后才考虑其他远处器官定植。

5.1 实验性肺转移模型

143B-luc、K7M2-luc 或 LM8 建立的实验性肺转移模型，适用于抗转移、抗定植、术后微小残留病灶以及循环后肺定植研究。实验通常采用尾静脉注射肿瘤细胞，重点评估肺定植和肺转移扩增过程；同种模型可使用 C57BL/6、BALB/c 或 C3H/He 等匹配背景，异种模型则多使用裸鼠或 NSG 小鼠。治疗周期一般为 2–6 周，高定植模型往往可以更早观察到肺内信号或结节形成。检测指标主要包括肺结节数、肺重量、IVIS 或 micro-CT 成像、生存及肺组织病理。阳性药物可采用 MAP 化疗简化方案或 cabozantinib、多靶点 TKI 作为转移抑制对照。该模型重复性较高、周期较短，更适合比较候选药物对肺定植环节的抑制能力，但其反映的是循环后定植过程，尚不足以完整代表自然转移全程。

5.2 原位自发肺转移模型

143B-luc、K7M2-luc 或 LM8 的长骨原位模型，可用于研究原发灶至肺转移的完整链条、围手术期治疗以及长期维持治疗。实验通常先建立胫骨或股骨原位瘤，随后在病程进展中自然形成肺转移；必要时可在原发灶达到一定负荷后进行局部切除、截肢或减瘤，再继续追踪肺转移复发。整体周期一般为 4–10 周，具体取决于原发灶生长速度、切除时机和肺转移形成时间。常用检测指标包括原发灶负荷、肺结节数、肺部 IVIS 信号、生存以及术后肺转移复发。阳性药物通常仍以 MAP 化疗简化方案为基础对照；若项目聚焦抗转移或围手术期治疗，也可加入多靶点 TKI 或 DDR 联合作为机制性参考。该模型更接近临床自然病程，对围手术期、复发抑制和长期维持治疗研究具有较高价值。

5.3 切除后肺复发模型

143B-luc、K7M2-luc 或 LM8 原位骨内模型联合原发灶切除或截肢后，可建立切除后肺复发模型，用于模拟术后肺复发、微小残留病灶以及围手术期治疗情境。具体做法通常是在胫骨原位模型形成后，于原发灶达到可切除窗口时实施局部切除或截肢，再观察肺转移复发进程。这一设计能够较好模拟临床中原发灶手术后肺部微小转移灶扩展的过程。实验周期通常包含原发灶生长期和术后观察期，因此整体时长往往长于单纯尾静脉肺转移模型。主要检测指标包括术后肺转移负荷、生存、复发时间及肺病理。若项目目标涉及围手术期治疗、术后辅助治疗或微小残留病灶清除，优先采用此类模型更有利于获得具有临床外推意义的结果。

六、同种免疫完整模型

同种模型的最大价值在于保留完整免疫系统，因此在免疫治疗、联合治疗、肿瘤微环境研究以及局部治疗研究中的优先级通常高于普通 CDX。对骨肉瘤而言，同种骨内原位模型较同种皮下模型更具转化意义，因为骨内环境、骨代谢和肺转移链条在原位场景下更接近真实疾病状态。

6.1 同种皮下模型

K7M2、LM8 或 MOS-J 皮下模型联合匹配品系小鼠，适合用于免疫检查点、STING、细胞因子、联合治疗以及初步 PK/PD 研究。常规造模方式为同品系鼠源细胞皮下接种，肿瘤达到约 50–100 mm³ 时入组。治疗周期一般为 10–21 天；由于同种瘤生长较快，免疫治疗通常需要较早启动，并注意监测体重变化及伪进展。检测指标主要包括肿瘤体积、生存、体重、流式免疫分型、细胞因子以及免疫组化或空间免疫分析。阳性药物可根据项目目的选择 MAP 化疗简化方案、多靶点 TKI、免疫检查点抑制剂或细胞因子策略。该类模型适合完成免疫治疗和联合治疗的第一轮筛选，但对骨内环境中的真实免疫效应仍难以充分呈现。

6.2 同种骨内原位模型

K7M2-luc 或 LM8 联合匹配品系小鼠建立的同种骨内原位模型，适用于免疫治疗、局部治疗、肿瘤微环境重塑、放疗联合以及肺转移研究。通常将鼠源骨肉瘤细胞建立于胫骨或股骨骨髓腔，并结合荧光素酶成像与 micro-CT 进行持续随访。治疗周期一般为 2–5 周；若研究重点涉及转移和免疫微环境，应在原发灶影像阳性后尽早干预，并保留肺转移形成窗口。检测指标包括原位骨肿瘤负荷、骨破坏、生存、肺转移及免疫浸润，机制性终点可进一步纳入流式细胞术、单细胞测序及 TCR 谱分析。阳性药物通常以 MAP 化疗简化方案作为基础对照；若项目聚焦免疫治疗或细胞治疗，则应加入相应机制性参考策略。对于任何免疫治疗或局部治疗项目，同种骨内原位模型往往是形成有力转化结论的重要支撑。

七、人源化免疫骨肉瘤模型

人源化模型适合回答普通 CDX 和同种模型难以充分覆盖的问题，尤其适用于双抗、T 细胞连接器（TCE）、CAR-T/NK、人源细胞因子以及强依赖人免疫效应的 ADC 或双抗项目。该类模型的重点不在于通量，而在于关键机制节点和转化价值的验证。

7.1 huPBMC 联合人源骨肉瘤细胞模型

huPBMC 联合人源骨肉瘤细胞模型适用于短周期免疫治疗筛选。可选细胞包括 143B、SJSA-1、U2OS、SaOS-2 以及其他靶点表达稳定的模型。该模型建模速度较快，通常 2–4 周即可进入实验阶段，适合开展短期免疫治疗、TCE 或 CAR-T/NK 研究。其主要局限在于 xGvHD 风险较高、治疗窗口较短，更适合获取短程检测读数，而不适用于长期机制研究。常用检测指标包括肿瘤负荷、人免疫细胞重建率、hCD45、hCD3、hCD8、hNK、细胞因子以及 CRS 和 xGvHD 风险指标。若项目聚焦 GD2 CAR-T、C7R-GD2.CAR 或其他高度依赖人免疫效应的细胞治疗，huPBMC 模型通常可作为第一步验证平台。

7.2 huHSC 联合人源骨肉瘤细胞模型

huHSC 联合人源骨肉瘤细胞模型更适合长周期人免疫重建、机制研究和复杂联合策略验证。其优势在于免疫重建更稳定，更适合较长周期的免疫治疗、ADC 联合、细胞治疗持续性及耐药研究；但该模型的准备时间长、成本较高，且供者差异较为明显。通常建议在候选药确认阶段，或在需要解释复杂免疫机制时引入此类模型。对于需要评估细胞治疗长期持久性、T 细胞衰竭或骨与肺双场景效应的项目，huHSC 模型通常比 huPBMC 模型具有更强的解释力。

八、术后复发与微小残留病灶模型

当骨肉瘤项目涉及复发抑制、围手术期治疗、原发灶切除后肺复发或微小残留病灶时，单纯皮下模型通常难以满足研究需求。更合适的方案是采用胫骨或股骨原位模型，在原发灶达到一定负荷后实施局部切除或截肢，并继续观察肺转移复发过程。常用模型包括 143B-luc、K7M2-luc 和 LM8。此类模型尤其适合评价围手术期化疗、靶向药物、细胞治疗以及微小残留病灶清除策略，对临床转化问题具有较强针对性。

九、项目升级路径建议

9.1 常规骨肉瘤药效项目

常规骨肉瘤药效项目建议采用“皮下 CDX 早筛—长骨原位模型验证骨微环境与长期疗效—必要时加入肺转移设计”的递进路径。若项目聚焦常规化疗增益、小分子药物或 ADC 优选，皮下模型通常可以完成首轮排序；若希望提高临床外推性，则应尽早加入原位骨内平台，以评估药物在真实骨微环境中的表现。

9.2 高转移与围手术期项目

高转移与围手术期项目建议采用“143B、K7M2、LM8 等高转移模型皮下早筛—长骨原位模型验证局部侵袭—原位自发肺转移或切除后肺复发模型验证”的升级路径。若项目重点在抗转移、围手术期治疗或术后辅助治疗，则模型体系应尽快覆盖原位自发转移或切除后肺复发场景，以增强研究结论的针对性。

9.3 DDR、PARP/ATR 与合成致死项目

DDR、PARP/ATR 与合成致死项目建议采用“匹配分层皮下模型早筛—原位模型验证骨内场景—必要时加入肺转移或复发模型”的路径推进。若项目属于明确的 DDR 分层策略，应在模型全流程中持续验证 DNA 损伤读数和通路状态，从而确保结果能够反映机制真实有效，而非仅仅停留在通用缩瘤现象层面。

9.4 B7-H3、GD2 与免疫治疗项目

B7-H3、GD2 与免疫治疗项目建议采用“皮下模型完成靶点和基础药效确认—同种皮下或 huPBMC 模型开展早期免疫验证—同种骨内原位或人源化模型深入验证”的路径。若项目涉及 HS-20093、GD2 CAR-T、C7R-GD2.CAR 或其他复杂免疫策略，应尽量引入骨内场景和长期观察设计，因为骨肉瘤免疫研究对原位环境和肺转移链条具有较强依赖性。

十、检测指标与阳性药体系

10.1 通用检测指标

不同模型的核心检测指标应根据研究重点进行配置。皮下模型通常以 TGI、RTV、终末瘤重和体重作为核心终点；原位模型更关注原位骨肿瘤体积、骨破坏、患肢肿胀和生存；肺转移模型则重点观察肺结节数、肺重量、IVIS 或 micro-CT 成像以及生存情况。免疫模型在机制层面通常需要增加 CD8、Treg、髓系细胞谱、细胞因子及人免疫重建率等指标。除此之外，还可根据项目需要加入 osteocalcin、Ki67、cleaved caspase-3、TRAP、ALP、γH2AX、RAD51 及药物组织分布等机制性终点，以提高结果解释深度。

10.2 阳性药推荐

在阳性药体系方面，常规骨肉瘤项目通常以 MAP 化疗框架的等效方案作为参考，其中多柔比星联合顺铂是最常见的动物实验对照。抗转移方向可将 cabozantinib 或多靶点 TKI 作为转移抑制对照；DDR 或合成致死方向可采用 olaparib 联合 ceralasertib 作为前沿研发参考；B7-H3 方向可使用 HS-20093 作为 ADC 机制参考；GD2 方向则更适合采用 GD2 CAR-T 或 C7R-GD2.CAR 作为细胞治疗方向的机制与研发参考。需要注意的是，这些前沿方案更适合用作研发参考，并不适合作为所有骨肉瘤项目统一适用的标准阳性药体系。

十一、优势与局限

皮下 CDX 的优势在于标准化程度高、重复性好、适合早期筛选和 PK/PD 研究，但其难以充分呈现骨内微环境、骨皮质破坏及真实肺转移链条。骨内原位模型更接近临床器官环境，适合研究骨破坏、局部侵袭、局部复发和长期疗效，但操作复杂、实验通量较低，且批间差异相对较大。实验性肺转移模型周期较短、检测重点清晰，适合回答器官定植问题，但对自然转移全过程的覆盖有限。同种免疫完整模型能够保留完整免疫系统，适合开展免疫治疗与肿瘤微环境研究，但鼠瘤与人瘤之间仍存在生物学差异。人源化免疫模型可用于评估人免疫依赖机制，但成本较高、实验噪声较大，且供者差异与 xGvHD 风险较为显著。

从整体研发逻辑看，骨肉瘤动物模型选择的关键在于研发问题与模型类型之间的匹配程度。对于常规骨肉瘤药效项目，应优先保证化疗框架与骨内场景相匹配；对于高转移和围手术期项目，应提高原位骨内、肺转移和切除后肺复发模型的优先级；对于 DDR、B7-H3、GD2 等靶向或免疫项目，应同时兼顾分层准确性、骨内环境及肺转移验证；对于免疫治疗项目，则建议坚持同种骨内原位优先的原则。整体上，采用“皮下早筛—原位验证—转移深化—免疫确认”的递进式路径，更有利于提升模型结果对骨肉瘤临床开发的支持价值。