南京博恩生物技术有限公司面向高校、科研院所、医药企业与生物技术企业，提供从方案评估、抗体 panel 设计、样本前处理、染色上机、圈门分析到结果解读的一站式流式细胞术实验外包服务。服务覆盖免疫细胞表型分析、细胞亚群分型、细胞活率检测、凋亡检测、细胞周期分析、细胞增殖分析、细胞因子胞内染色、膜蛋白表达分析、磷酸化蛋白流式检测、肿瘤微环境免疫分型、干细胞与分化细胞表型分析及发表级图版整理。

流式细胞术是一种基于单细胞悬液、多参数荧光检测和高速光学分析的技术，可在单细胞水平同时检测多个表面或胞内标志物。核心要点为：多参数、单细胞、定量分析，并强调 controls、compensation 和 calibration 对准确分析至关重要。

交付包含原始流式数据、统计图、群体比例结果表及完整中文报告。
项目完成后提供终身售后支持，针对圈门解释、图版整理、投稿补充材料准备及后续问题持续响应。

服务适用场景

本服务适用于免疫细胞分群分析、肿瘤免疫微环境分析、T 细胞功能分型、巨噬细胞极化分析、树突细胞亚群分析、NK 细胞分析、MDSC 分型、细胞凋亡检测、细胞周期分析、增殖检测、细胞内细胞因子检测、磷酸化信号通路检测、干细胞与分化细胞表型分析及药物干预前后细胞状态变化比较。

流式细胞术特别适合回答以下问题：
某一类细胞在混合细胞群中占比是多少、不同亚群是否发生变化、阳性率是否升高、某种功能 marker 是否上调、细胞是否凋亡、是否处于增殖状态、是否存在免疫抑制性群体等。与 Western blot 相比，流式不提供蛋白分子量信息；与免疫荧光相比，流式更擅长做大量单细胞定量；与 ELISA 相比，流式更擅长回答“是哪类细胞表达”。

适用客户类型

• 高校与科研院所：免疫表型分析、机制研究、论文数据补充

• 医药企业：药效免疫评价、细胞治疗质量分析、靶点与通路检测

• 生物技术企业：抗体验证、细胞产品表型分析、多参数筛查

适用研究方向

• 肿瘤免疫微环境分析

• T 细胞、B 细胞、NK      细胞、髓系细胞分群

• 巨噬细胞极化与免疫抑制微环境

• 细胞凋亡、活率、增殖、周期检测

• 细胞因子胞内染色

• 磷酸化信号通路流式检测

• 干细胞、祖细胞和分化细胞表型分析

服务流程

客户发送方案 → 方案评估 → 问题反馈与优化 → 正式报价 → 签订合同 → 支付预付款 → 开始实验 → 提交 PDF 版结果报告 → 支付尾款 → 提交完整报告。

流程说明

1. 客户发送方案
提交研究目的、样本类型、物种、分组设计、目标细胞群、目标 marker、参考文献及预期分析方式。

2. 方案评估
评估样本是否适合流式检测，确认 panel 设计、荧光通道分配、是否需活死染、是否需胞内染色、是否需刺激封闭、是否需磷酸化流式。

3. 问题反馈与优化
指出方案中可能存在的问题，如 marker 搭配不合理、种属不匹配、panel 串色风险高、圈门逻辑不完整、M1/M2 或 Th 亚群判定过于单一等，并进行优化。

4. 正式报价
根据样本数量、检测指标、颜色数、是否胞内染色、是否功能刺激、是否需复杂圈门分析和发表级图版整理等出具正式报价。

5. 签订合同并支付预付款
确认合作内容、周期及交付标准。

6. 开始实验
进入样本制备、计数、染色、补偿设置、上机采集、圈门分析和统计流程。

7. 提交 PDF 结果报告
实验完成后先提交 PDF 版结果报告供客户确认。

8. 支付尾款并提交完整报告
尾款支付完成后，提交完整终版报告、原始 FCS 数据、圈门图、统计图及整理版发表素材。

样本要求

流式细胞术要求样本尽可能制备为高质量单细胞悬液，并尽量减少碎片、团聚、死亡细胞和红细胞污染。

样本要求表

样本说明

• 样本中碎片、团聚和死亡细胞过多会显著影响圈门准确性

• 多色实验建议同步提供补偿和对照方案

• 核内转录因子、胞内细胞因子、磷酸化蛋白检测，前处理策略与表面染色不同

• 肿瘤组织流式分析通常需先充分消化并过滤成单细胞悬液。

交付内容

交付内容包含中文版实验报告、样本信息、抗体 panel 信息、实验方法、补偿与对照说明、原始 FCS 数据、圈门图、群体比例统计表、荧光强度分析结果、图注、结果描述、结论总结及完整终版报告。

标准交付清单

• 中文版实验报告

• 样本与抗体 panel 信息

• 实验方法学描述

• 原始 FCS 数据

• 圈门策略图

• 群体比例统计表

• 荧光强度分析结果

• 代表性散点图/直方图

• 发表级图版整理

• 完整终版报告

售后支持

项目完成后提供终身售后支持，包括：

• 圈门解释

• 亚群定义说明

• 图版整理

• 投稿补充材料支持

• 后续答疑与补充说明

周期与报价方式

常规流式细胞术项目周期通常为 20–40个工作日。涉及多色 panel 设计、复杂组织消化、胞内染色、核内转录因子染色、刺激后细胞因子检测、磷酸化流式检测、复杂圈门分析或发表级图版整理的项目周期相应延长。

报价因素

• 样本数量

• panel 颜色数

• 检测指标数量

• 是否需胞内/核内染色

• 是否需刺激封闭实验

• 是否需活死染和复杂对照

• 是否需多层级圈门分析

• 是否需发表级图像整理

常见问题

流式细胞术适合解决什么问题？
流式特别适合解决“某一群细胞占比多少”“不同亚群是否变化”“某种功能蛋白在哪类细胞中表达”“细胞是否凋亡/增殖/激活”等问题。它是单细胞、多参数、定量分析平台。

流式和免疫荧光的区别是什么？
流式适合做大量单细胞定量和亚群比例分析；免疫荧光更适合看空间定位、细胞形态和共定位。

流式和 Western blot 的区别是什么？
流式用于单细胞层面的群体分析；Western blot 用于蛋白大小、条带特异性和修饰状态分析。

为什么流式必须重视补偿和对照？
因为多色流式存在荧光溢漏，compensation 只能校正荧光串入，不能解决由溢漏带来的 spread；FMO 对照有助于设置复杂 panel 的阴阳性边界。

结果是否可直接用于发表？
交付包含原始数据、圈门图、统计图、图注说明及整理版图版，可直接用于论文、汇报和结题材料整理。

流式细胞术原理

流式细胞术通过让单个细胞依次通过激光检测区域，记录前向散射光、侧向散射光及多个荧光通道信号，从而在单细胞水平分析细胞大小、内部复杂度和标志物表达。

流式细胞术实验步骤与逐项说明

1. 样本制备

将样本制备为尽量均一的单细胞悬液，必要时去红、过滤和计数。组织样本需消化并去除团聚和碎片。

2. 细胞计数与活率评估

确认细胞浓度和活率，保证上机样本质量。死亡细胞过多会显著增加背景和非特异性结合。

3. 对照设置

根据实验设计设置空白对照、单染补偿对照、FMO 对照、生物学对照及必要的同型对照。

4. 表面染色

先进行表面 marker 染色。若后续涉及胞内细胞因子或核内转录因子，则表面染色一般优先于固定破膜步骤。

5. 活死染

加入 viability dye 排除死亡细胞。死亡细胞常表现为非特异性高背景，是流式圈门中必须优先去除的群体。

6. 固定与破膜

胞内因子、核内转录因子和磷酸化蛋白检测通常需要固定和破膜。不同检测对象需采用不同体系。

7. 胞内/核内染色

进行细胞因子、FoxP3、T-bet、GATA3、RORγt 等胞内或核内 marker 染色。

8. 补偿设置

使用单染对照建立 compensation matrix，校正荧光溢漏。

9. 上机采集

根据目标群体丰度和分析需求设置采集细胞数。低频群体通常需要更高事件数以保证统计可靠性。

10. 圈门分析

按预设逻辑逐层圈门，得到目标群体比例、荧光强度或功能状态结果。

流式圈门步骤详解

流式圈门是结果可靠性的核心。

常规圈门流程

第一步：去碎片
先在 FSC-A 与 SSC-A 图上圈出主要细胞群，去除碎片和极低散射信号事件。
目的：排除细胞碎片和杂质。

第二步：去双ts/聚团
在 FSC-A vs FSC-H 或 FSC-A vs FSC-W 图上圈 singlets。
目的：排除细胞团聚，避免双细胞误判为高表达阳性群体。
这是流式基础步骤之一，很多比例偏高或双阳性假象都与未充分去 doublets 有关。

第三步：排除死亡细胞
使用 viability dye 去除死细胞群。
目的：减少非特异性结合和背景高的问题。
对于组织样本、冻存样本和刺激样本，这一步尤其重要。

第四步：根据生物学对象圈总群体
例如：

• 免疫细胞分析常先圈 CD45+

• T 细胞分析常在 CD45+ 中圈 CD3+

• 肿瘤组织常先圈 CD45- 肿瘤群和 CD45+ 免疫群再分别分析
       目的：建立正确的分析母群体。

第五步：进入主亚群圈门
例如：

• CD3+ → CD4+ / CD8+

• CD11b+ → 髓系群 → 中性粒/单核/巨噬

• CD11c+ MHC II+ → 树突细胞群

• CD3- NKp46+ / NK1.1+ → NK 群
       目的：从母群体中拆分到目标亚群。

第六步：做功能/极化/状态圈门
例如：

• Treg：CD3+ CD4+ FoxP3+ CD25+

• Th17：CD3+ CD4+ RORγt+ IL-17A+

• M1-like：CD68 或      F4/80 基础上看 iNOS/CD80/CD86

• M2-like：CD68 或      F4/80 基础上看 CD163/CD206/Arginase-1

• Exhausted T：PD-1/TIM-3/LAG-3 组合
       目的：在基础细胞谱系上定义功能状态，而不是只靠单一 marker。

第七步：使用 FMO 设阴阳性边界
BD 指出 FMO 对照是“包含 panel 中除目标通道以外的所有抗体”的对照，可帮助判定背景和 spillover spread；Abcam 也说明 FMO 能帮助准确设置 gating boundary。
对于 8 色以上、弱阳性群体、连续分布群体和组织来源样本，FMO 特别重要。

第八步：输出比例和强度指标
常见输出包括：

• 群体占父群体比例

• 群体占总细胞比例

• MFI（平均荧光强度）

• 阳性率

• 双阳性/三阳性比例
       目的：根据研究问题输出最合适的统计指标。

圈门中常见问题

• 未排除碎片导致“假阳性”升高

• 未去 singlets 导致双阳性比例虚高

• 未去死细胞导致背景偏高

• 直接用空白设门而不用 FMO，导致弱阳性群体划门不准

• 只看单一 marker 就定义复杂细胞亚群

• 把人 marker 直接套到小鼠模型
       这些都是流式结果偏差的高发原因。

流式细胞术应用场景总表

常见细胞群 marker 选择表

免疫细胞极化与功能亚群 marker 表

T 细胞亚群

对 Treg 与 Th17 的 marker 定义都采用多 marker 组合。

巨噬细胞极化

树突细胞、中性粒、MDSC 等

种属差异说明

流式实验中，样本物种 与 抗体来源物种 是两个不同层面的问题：
样本物种决定某个 marker 是否适合目标样本；抗体来源物种决定后续补偿与 panel 设计中的试剂选择。对于免疫细胞分型，人和小鼠的 marker 体系不能直接照搬。

最常见的差异包括：

• 巨噬细胞：人常用 CD68/CD163，小鼠更常用 F4/80。

• pDC：人常用 CD123/CD303/CD304，小鼠常用      Siglec-H/CD317。

• 中性粒细胞：人常用 CD15/CD16，小鼠更常用 Ly6G。

• MDSC：人常用 CD33/HLA-DR low，小鼠常用      Gr1/Ly6C/Ly6G。

• NK：人常用 CD56，小鼠常用 NK1.1/NKp46，且 NK1.1 并非所有小鼠品系都适用。

南京博恩生物技术有限公司提供面向科研客户与医药企业的流式细胞术实验外包服务，覆盖免疫细胞分型、功能亚群分析、肿瘤免疫微环境评估、细胞凋亡与周期检测、细胞因子胞内染色及发表级图版整理。项目交付包含原始 FCS 数据、圈门图、统计分析图、结果表及完整中文报告，并提供终身售后支持。
客户提交方案后，项目按“方案评估—问题反馈—报价签约—实验执行—PDF 结果确认—完整报告交付”的标准流程推进。交付结果可直接用于课题研究、论文整理、项目申报与结题汇报。