南京博恩生物技术有限公司面向高校、科研院所、医药企业与生物技术企业，提供从方案评估、抗体筛选、样品检测到结果分析的一站式 Western blot 实验外包服务。服务覆盖常规蛋白表达检测、磷酸化蛋白检测、切割体检测、信号通路验证、药效机制研究、核蛋白/膜蛋白/线粒体蛋白检测、发表级图像整理与数据分析。Western blot 可同时提供分子量信息、条带特异性和部分翻译后修饰信息，因此在通路激活、蛋白切割、自噬通量和 DNA damage 等场景中具有明确优势。

常规种属、常规通路所需抗体由公司提供，客户无需额外提供或代购。
交付包含未裁剪整膜全长蛋白分子量标准曝光图、统计分析图、灰度值数据、发表级大图及完整中文报告。
项目完成后提供终身售后支持，针对图版整理、结果解释、投稿补充材料准备及后续问题持续响应。

服务适用场景

本服务适用于基础研究中的目标蛋白表达验证、信号通路激活状态分析、药物刺激前后蛋白变化比较、细胞表型机制验证、核蛋白转位研究、膜蛋白表达分析、线粒体功能相关蛋白检测、分泌相关机制研究、文章发表配套数据整理、药效评价、转录后修饰验证及生物医药研发中的靶点机制研究。对于以磷酸化、切割体、活性形式或蛋白定位变化为核心检测指标的研究问题，Western blot 直接对应蛋白层面的科学问题，而 qPCR 对应的是转录水平问题，二者不可互相替代。

适用客户类型

·        高校与科研院所：课题验证、机制研究、论文发表、结题配图

·        医药企业：靶点机制验证、药效通路验证、候选药物筛选

·        生物技术企业：产品功能验证、信号通路评估、项目研发支持

适用研究方向

·        细胞增殖、凋亡、自噬、迁移、侵袭

·        炎症、免疫、纤维化、EMT、DNA 损伤

·        肿瘤信号通路、代谢通路、缺氧应答

·        蛋白磷酸化、蛋白切割、蛋白稳定化、核转位

服务流程

客户发送方案 → 方案评估 → 问题反馈与优化 → 正式报价 → 签订合同 → 支付预付款 → 开始实验 → 提交 PDF 版结果报告 → 支付尾款 → 提交完整报告。

流程说明

1. 客户发送方案
提交研究目的、分组设计、目标蛋白、样本类型、处理条件及参考文献等。

2. 方案评估
评估实验可行性、抗体选择、内参设置、目标位点设置及样本设计合理性。

3. 问题反馈与优化
指出方案中可能存在的问题，如目标蛋白不适合只做 PCR、磷酸化位点设置不完整、内参选择不恰当等，并提供优化方案。

4. 正式报价
根据样本数量、检测指标、是否涉及修饰位点、是否需分级提取、是否需发表级整理等出具正式报价。

5. 签订合同并支付预付款
确认合作内容、周期及交付标准。

6. 开始实验
进入样本处理、蛋白提取、定量、电泳、转膜、孵育、显影和分析流程。

7. 提交 PDF 结果报告
实验完成后先提交 PDF 版结果报告供客户确认。

8. 支付尾款并提交完整报告
尾款支付完成后，提交完整终版报告、原始图、整膜图、灰度值数据及发表级整理图版。

样本要求

Western blot 的结果质量高度依赖样本质量、保存方式和目标蛋白特性。实验前应明确目标蛋白的大小、细胞定位、溶解性、翻译后修饰、异构体及丰度；对低丰度蛋白、核蛋白和膜蛋白，应优先考虑分级提取以提高信噪比。

样本要求表

补充说明
常规种属、常规通路抗体无需客户额外提供或代购，由公司统一配套。
对于特殊种属、特殊位点、稀有蛋白、定制化项目，再根据项目需求单独评估。

交付内容

交付内容包含中文版实验报告、试剂信息、仪器信息、实验方法、统计学方法、图注、结果描述、结论总结、统计分析后的结果图、合并整理后可直接用于文章发表的大图、灰度值分析表、归一化分析结果表、未裁剪整膜孵育抗体的全长蛋白分子量标准曝光图、原始条带图、原始数据文件及完整终版报告。结果为统计与分析完成后的版本，可直接用于论文、结题、汇报和项目归档。

标准交付清单

·        中文版实验报告

·        试剂与仪器信息

·        实验方法学描述

·        图注与结果说明

·        灰度值分析表

·        统计分析结果图

·        归一化分析图

·        发表级合成大图

·        原始条带图

·        未裁剪整膜全长蛋白分子量标准曝光图

·        完整终版报告

售后支持

项目完成后提供终身售后支持，包括：

·        结果解释

·        图版整理

·        投稿补充材料支持

·        后续答疑与补充说明

周期与报价方式

常规 Western blot 项目周期一般为10–30 个工作日。涉及多指标检测、核蛋白/膜蛋白提取、磷酸化蛋白优化、抗体筛选、重复实验、补实验及复杂图像整理的项目周期相应延长。报价根据样本数量、检测指标数量、是否涉及修饰蛋白、是否需分级提取、是否需代购特殊抗体、是否需重复实验、是否需发表级拼图与深度分析综合确定。

报价因素

·        样本数量

·        目标蛋白数量

·        是否检测磷酸化位点或切割体

·        是否涉及核蛋白、膜蛋白、线粒体蛋白

·        是否需要重复验证

·        是否涉及特殊种属、特殊位点或定制抗体

常见问题

为什么有些项目做 Western blot，而不是只做 PCR？
PCR 检测 mRNA，Western blot 检测蛋白。AKT、ERK、STAT3、p65、AMPK、mTOR、Smad2/3 等通路节点更核心的是磷酸化活化状态；Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP 的核心是蛋白切割；LC3B 的核心是 LC3-I/LC3-II 转换；β-catenin 的核心是活性形式。以上这些核心检测指标均不能用 qPCR 替代。

磷酸化蛋白如何检测？
磷酸化蛋白检测需同步检测总蛋白，样本处理过程中加入磷酸酶抑制剂，裂解和运输全程低温，结果分析采用磷酸化蛋白与总蛋白配对解释。

内参如何确定？
全细胞、核蛋白、膜蛋白、线粒体蛋白、胞浆蛋白和上清样本使用不同的归一化策略，不能统一使用 GAPDH 或 β-Actin。

常规抗体是否需要客户自备？
常规种属、常规通路抗体由公司提供，客户无需额外提供或代购。

是否可直接用于发表？
交付包含统计图、整膜图、图注、方法学描述和发表级拼图素材，可直接用于论文整理和项目汇报。

Western blot 原理

Western blot 是将样本中的蛋白先经 SDS-PAGE 按分子量分离，再转移至膜上，随后利用抗体与目标蛋白特异性结合，通过化学发光或其他检测方式显示条带位置和强度，从而实现蛋白鉴定与表达分析。该方法兼具凝胶电泳的分辨能力与免疫学检测的特异性，因此不仅能判断蛋白是否表达，还能判断蛋白大小是否正确、是否发生切割及是否存在翻译后修饰。

Western blot 实验步骤

1. 样本制备

根据目标蛋白的大小、定位、溶解性、翻译后修饰及丰度选择合适的裂解方式。核蛋白、膜蛋白、线粒体蛋白和低丰度蛋白优先采用分级提取。磷酸化蛋白检测需加入磷酸酶抑制剂，常规蛋白检测需加入蛋白酶抑制剂。

2. 蛋白定量

通过 BCA、Bradford 或 Lowry 法定量，保证各组上样量一致。蛋白定量是确保上样足量且等量的关键步骤。

3. 变性与上样

常规 Western blot 使用 SDS 和还原剂处理样本，使蛋白线性化并按分子量分离。若抗体仅识别非还原构象，则采用非还原条件。

4. SDS-PAGE 电泳

利用聚丙烯酰胺凝胶对蛋白按分子量进行分离。目标蛋白分子量越明确，电泳胶浓度和跑胶条件越容易优化。

5. 转膜

将凝胶中的蛋白转移至 PVDF 或 NC 膜。高分子量蛋白、低分子量蛋白和膜蛋白通常需要不同的转膜参数。

6. 封闭

利用封闭液阻断膜上非特异性结合位点。磷酸化蛋白检测中，部分抗体更适合使用 BSA 封闭。

7. 一抗孵育

根据目标蛋白及修饰位点选择一抗，并根据抗体说明书优化稀释比例和孵育条件。常规种属、常规通路抗体由公司提供。

8. 二抗孵育

选择与一抗种属匹配的二抗进行孵育，保证检测体系一致性与特异性。

9. 显影与成像

通过化学发光等方式获取条带图像，同时保留未裁剪整膜全长蛋白分子量标准曝光图，便于结果存档和发表使用。

10. 灰度分析与统计

对目标条带进行灰度值分析，结合内参或总蛋白归一化，输出统计图、差异分析结果和适合发表的拼图素材。

Western blot 与 ELISA、免疫组化、流式、免疫荧光对比分析

实验选择逻辑

常见通路western blot应用推荐

下表按通路名称、研究场景、推荐检测蛋白、推荐位点、位点意义和 PCR 配套逻辑整理。

内参选择建议

内参选择需结合样本来源、亚细胞定位和处理条件；线粒体常用 COX IV 等，核蛋白常用 Histone H3 等。

Western blot 与 PCR 的配套逻辑

qPCR 用于检测基因转录水平，Western blot 用于检测蛋白表达、分子量、切割体和翻译后修饰。
以下这些检测指标应以 Western blot 为核心，不以 PCR 为核心：
AKT、ERK、p38、JNK、STAT3、p65、mTOR、S6K、4E-BP1、Smad2/3、active β-catenin、GSK3β、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、LC3-I/II、γH2AX、p-EGFR、p-Src。

以下方向适合采用 “Western blot + qPCR” 联合验证：
NF-κB 下游炎症因子、TGF-β/Smad 下游纤维化基因、Wnt 下游靶基因、凋亡相关转录输出、自噬相关基因表达、EMT 表型基因、缺氧应答基因。

南京博恩生物技术有限公司提供面向科研客户与医药企业的 Western blot 实验外包服务，覆盖目标蛋白表达检测、信号通路验证、转录后修饰分析、蛋白切割检测、核蛋白/膜蛋白/线粒体蛋白检测及发表级结果整理。常规种属、常规通路抗体由公司提供，客户无需额外提供或代购。项目交付包含未裁剪整膜全长蛋白分子量标准曝光图、统计分析图、灰度值数据、发表级大图及完整中文报告，并提供终身售后支持。
客户提交方案后，项目按“方案评估—问题反馈—报价签约—实验执行—PDF 结果确认—完整报告交付”的标准流程推进。交付结果可直接用于课题研究、论文整理、项目申报与结题汇报。

案例