常规种属、常规通路所需抗体由公司提供，客户无需额外提供或代购。

交付包含未裁剪整膜全长蛋白分子量标准曝光图、统计分析图、灰度值数据、发表级大图及完整中文报告。

项目完成后提供终身售后支持，针对图版整理、结果解释、投稿补充材料准备及后续问题持续响应。

导读

一、服务定位与核心优势
二、服务范围与适用场景
三、服务流程
四、交付内容与交付标准
五、售后支持
附录A 送样要求与样本规范
附录B 常见问题
附录C Western blot 与其他技术对比
附录D 内参与归一化选择要点
附录E 经典通路与推荐检测指标

一、服务定位与核心优势

南京博恩生物技术有限公司面向高校、科研院所、医药企业与生物技术企业，提供从方案评估、抗体筛选、样品检测到结果分析的一站式 Western blot 实验外包服务。

1.1 服务定位

公司可提供以下类型的 Western blot 相关服务：

（1）常规蛋白表达检测
（2）磷酸化或其他修饰蛋白检测
（3）切割体及活化形式蛋白检测
（4）信号通路验证
（5）药效与作用机制研究
（6）核蛋白、膜蛋白、线粒体蛋白检测
（7）发表级图像整理与数据分析

1.2 核心优势

（1）常规种属、常规通路所需抗体由公司提供，客户通常无需额外提供或代购。
（2）交付内容完整，包括未裁剪整膜全长蛋白分子量标准曝光图、统计分析图、灰度值数据、发表级大图及完整中文报告。
（3）服务覆盖实验前评估、实验执行、结果分析、图版整理和后续答疑等完整环节。
（4）项目完成后提供长期售后支持，可持续配合图版整理、结果解释、投稿补充材料准备及后续问题处理。

二、服务范围与适用场景

2.1 可提供的检测类型

（1）常规总蛋白表达检测（目标蛋白与归一化分析）
（2）磷酸化或修饰蛋白检测（p-蛋白与对应 total 蛋白配对）
（3）切割体或活化形式检测（如 cleaved、active、non-phospho active）
（4）分级提取与检测（核/胞浆、膜蛋白、线粒体蛋白）
（5）自噬通量相关检测（如 LC3-I/LC3-II、p62 等组合判断）
（6）DNA 损伤及应激相关检测（如 γH2AX、ATM/ATR、CHK1/CHK2 等）
（7）受体及黏附迁移相关检测（如 RTK、FAK/Src、Integrin 等）
（8）培养上清或分泌相关蛋白检测
（9）外泌体或细胞外囊泡标志物检测

2.2 适用客户类型

（1）高校与科研院所：适用于课题验证、机制研究、论文发表与结题配图。
（2）医药企业：适用于靶点机制验证、药效通路验证及候选药物筛选。
（3）生物技术企业：适用于产品功能验证、信号通路评估及研发项目支持。

2.3 适用研究方向

（1）细胞增殖、凋亡、自噬、迁移与侵袭
（2）炎症、免疫、纤维化、EMT 与 DNA 损伤
（3）肿瘤信号通路、代谢通路与缺氧应答
（4）蛋白磷酸化、蛋白切割、蛋白稳定化及核转位

2.4 方法应用说明

对于以磷酸化、切割体、活性形式或定位变化为核心证据的研究问题，Western blot 可提供蛋白层面的关键证据；qPCR 主要提供转录水平信息。两类方法适用于不同层面的研究判断，通常需要结合使用。

三、服务流程

3.1 标准流程

客户发送方案 → 方案评估 → 问题反馈与优化 → 正式报价 → 签订合同 → 支付预付款 → 开始实验 → 提交 PDF 版结果报告 → 支付尾款 → 提交完整报告

3.2 流程说明

（1）客户发送方案
提交研究目的、分组设计、目标蛋白、样本类型、处理条件及参考文献等基础信息。

（2）方案评估
评估实验可行性、抗体选择、内参设置、目标位点设置及样本设计合理性。

（3）问题反馈与优化
对方案中可能影响结果解释或实验完成度的问题提出建议，例如蛋白层面证据不足、位点设置不完整或内参选择不恰当等，并同步提供优化意见。

（4）正式报价
根据样本数量、检测指标、是否涉及修饰位点、是否需要分级提取、是否需要发表级整理等因素形成正式报价单。

（5）签订合同与预付款
在确认合作内容、项目周期及交付标准后启动项目。

（6）提交 PDF 结果报告
实验完成后，先提供 PDF 结果报告供客户确认。

（7）提交完整报告
尾款支付完成后，提交完整终版报告、原始图、整膜图、灰度值数据及发表级整理图版。

四、交付内容与交付标准

4.1 交付内容概述

交付内容包括中文版实验报告、试剂信息、仪器信息、统计学方法、图注、结果描述、结论总结、统计分析结果图、可用于文章发表的大图素材、灰度值分析表、归一化分析结果表、未裁剪整膜全长蛋白分子量标准曝光图、原始条带图、原始数据文件及完整终版报告。

4.2 标准交付清单

（1）中文版实验报告（含结果与图注）
（2）试剂与仪器信息
（3）原始条带图与关键曝光图
（4）未裁剪整膜全长蛋白分子量标准曝光图（含 marker 信息）
（5）灰度值分析表与归一化结果表
（6）统计分析结果图（含必要统计说明）
（7）发表级合成大图素材（统一版式输出）
（8）完整终版报告文件与可追溯原始数据

4.3 交付特点

（1）交付链条完整，便于科研归档、论文整理与项目汇报。
（2）原始图、整膜图、灰度值数据与发表级图版同步提供，有利于结果追溯与后续补充。
（3）报告内容以中文呈现，方便客户内部沟通、项目汇报及后续使用。

五、售后支持

项目完成后提供长期售后支持，包括结果解释、图版整理、投稿补充材料支持、后续答疑与补充说明。

5.1 售后支持内容

（1）结果解释与数据沟通
（2）图版整理与版式优化建议
（3）投稿补充材料准备支持
（4）后续问题答疑与补充说明

5.2 售后支持特点

（1）支持范围覆盖项目完成后的常见延伸需求。
（2）可持续配合客户开展论文整理、结题汇报及投稿补充工作。
（3）有助于提高项目结果使用效率与后续转化效率。

附录A 送样要求与样本规范

A1 总体说明

Western blot 结果质量与样本质量、保存方式及目标蛋白特性密切相关。送样前建议明确目标蛋白分子量、亚细胞定位、溶解性、翻译后修饰、异构体与丰度。对于低丰度蛋白、核蛋白及膜蛋白，优先考虑分级提取，以提高信噪比和检测稳定性。

A2 样本类型与要求

A2.1 新鲜组织样本

（1）建议量：每个样本 100–150 mg
（2）保存运输：取材后尽快液氮速冻，-80℃ 保存，干冰运输
（3）说明：适用于常规组织蛋白检测

A2.2 细胞沉淀

（1）建议量：每个样本不少于 5×10^6 个细胞；复杂项目建议不少于 1×10^7 个细胞
（2）保存运输：离心后弃上清，速冻保存，干冰运输
（3）说明：低丰度蛋白、多指标项目及磷酸化蛋白检测建议提高送样量

A2.3 细胞或组织裂解液

（1）建议量：总蛋白浓度不低于 1 mg/mL；单个样本体积不低于 50 μL
（2）保存运输：-80℃ 保存，干冰运输，避免反复冻融
（3）说明：多指标项目建议提高体积与浓度

A2.4 核蛋白样本

（1）建议：优先提供核蛋白提取样本或委托分级提取
（2）保存运输：全程低温，加入蛋白酶抑制剂；涉及磷酸化检测时同步加入磷酸酶抑制剂
（3）说明：适用于核转录因子及核转位蛋白检测

A2.5 膜蛋白样本

（1）建议：优先提供膜蛋白提取样本或委托分级提取
（2）保存运输：全程低温，避免强烈冻融
（3）说明：膜蛋白采用全裂解液检测时，常见信号偏弱或背景升高，分级提取通常更稳妥

A2.6 线粒体蛋白样本

（1）建议：提供线粒体富集样本或委托分级提取
（2）保存运输：全程低温
（3）说明：适用于代谢、凋亡及氧化磷酸化相关研究

A2.7 分泌蛋白或培养上清

（1）建议：根据目标蛋白丰度评估是否需要浓缩
（2）保存运输：上清低温离心去杂后冻存，干冰运输
（3）说明：上清样本的归一化策略与细胞裂解液不同，通常不以传统内参蛋白作为默认归一化依据

A2.8 磷酸化蛋白检测样本

（1）建议：适当增加样本量
（2）保存运输：裂解时加入磷酸酶抑制剂，全程低温并快速处理
（3）说明：建议与对应 total 蛋白配对解释，以提高结果判断准确性

A3 客户需提供的信息清单

（1）目标蛋白全称、物种、预期分子量与关注形式（如 total、p-位点、cleaved、active、核转位等）
（2）样本类型与数量、分组信息、处理条件（药物、时间、剂量、刺激条件等）
（3）是否需要分级提取（核/胞浆、膜、线粒体）
（4）参考文献或已知阳性对照信息
（5）是否需要发表级图像整理与图版输出

附录B 常见问题

B1 为什么不能仅用 qPCR 代替 Western blot

qPCR 反映 mRNA 水平；Western blot 反映蛋白表达、分子量、切割体及翻译后修饰。对于通路节点激活状态、执行性事件和自噬通量等问题，Western blot 能提供更直接的蛋白层面证据。qPCR 更适合用于补充转录水平信息，两者通常结合使用更有利于形成完整证据链。

B2 磷酸化蛋白如何检测与解释

磷酸化蛋白建议与对应 total 蛋白同步检测。样本裂解时需加入磷酸酶抑制剂，并保持全程低温。结果解释宜以 p-蛋白与 total 蛋白的配对分析为主。

B3 常规抗体是否需要客户自备

常规种属、常规通路所需抗体通常由公司提供；特殊种属、特殊位点或稀有蛋白可根据项目实际情况评估。

B4 是否可以直接用于发表

交付内容包括未裁剪整膜图、灰度值数据、统计图、图注、材料信息及发表级拼图素材，可用于论文整理、结题和汇报等工作。

附录C Western blot 与其他技术对比

C1 Western blot

C1.1 用途侧重

表达、分子量、修饰或切割、激活状态

C1.2 优势

可见条带与分子量信息，可配对检测修饰形式与 total 蛋白

C1.3 局限

通量相对较低，对样本质量与抗体特异性有一定依赖

C2 ELISA

C2.1 用途侧重

高通量定量检测，如细胞因子、分泌蛋白、血清或培养上清指标

C2.2 优势

灵敏度较高，定量能力与通量优势明显

C2.3 局限

通常不提供分子量信息

C3 免疫组化（IHC）

C3.1 用途侧重

组织定位与病理空间信息

C3.2 优势

定位信息直观

C3.3 局限

定量能力相对较弱

C4 流式细胞术

C4.1 用途侧重

单细胞、多参数、细胞亚群与比例分析

C4.2 优势

单细胞分辨率高，通量高

C4.3 局限

通常不提供分子量与条带信息

C5 免疫荧光（IF）

C5.1 用途侧重

定位、转位、共定位与形态学展示

C5.2 优势

定位结果直观

C5.3 局限

定量结果受成像与分析流程影响较大

附录D 内参与归一化选择要点

D1 总体原则

（1）优先匹配样本组分：核蛋白宜采用核内参，膜蛋白宜采用膜内参，线粒体蛋白宜采用线粒体内参；上清或分泌样本通常不默认采用细胞内内参蛋白。
（2）当处理条件可能影响传统内参蛋白稳定性时，建议优先采用总蛋白归一化，或在验证内参稳定性后再使用相应内参。
（3）建议避免长期固定使用单一内参；必要时可采用“总蛋白归一化 + 备用内参”组合策略。

D2 常用内参的适用与注意事项

D2.1 β-Actin（ACTB）

（1）适用：多数常规细胞或组织总蛋白样本
（2）注意事项：在细胞骨架显著重排相关研究中需谨慎使用，如 EMT、迁移侵袭、Rho/ROCK 强激活、机械转导及肌动蛋白相关药物处理等

D2.2 GAPDH

（1）适用：多数常规总蛋白样本，尤其适用于代谢稳态条件
（2）注意事项：在缺氧、HIF-1、糖酵解及代谢重编程干预明显的模型中需谨慎使用

D2.3 α/β-Tubulin（TUBA/TUBB）

（1）适用：多数常规总蛋白样本，适用于微管稳态条件
（2）注意事项：在微管药物处理、微管动力学强干预或有丝分裂阻滞模型中需谨慎使用

D2.4 Vinculin（VCL）

（1）适用：当目标条带与 42–55 kDa 区域重叠时，可作为备选内参
（2）注意事项：在黏附斑及黏附迁移强干预模型中需谨慎使用

D2.5 Histone H3

（1）适用：核蛋白或核提取样本归一化
（2）注意事项：通常不用于全细胞总蛋白归一化

D2.6 Na⁺/K⁺-ATPase（ATP1A1）

（1）适用：膜蛋白或膜富集组分归一化
（2）注意事项：不建议用于核或线粒体组分

D2.7 COX IV（COX4I1）、VDAC1、TOMM20

（1）适用：线粒体富集组分归一化
（2）注意事项：全细胞样本与线粒体富集样本不宜直接采用同一归一化逻辑

D2.8 上清、分泌样本与细胞外囊泡

（1）适用：总蛋白归一化、上样体积标准化及膜染总蛋白信号；细胞外囊泡可结合 CD9、CD63、CD81、TSG101、ALIX 等标志物组合分析
（2）注意事项：上清和细胞外囊泡样本通常不默认采用 GAPDH、ACTB 或 Tubulin 作为内参

D3 总蛋白归一化优先场景

在缺氧与代谢干预、EMT 与迁移研究、微管药物处理、强应激与凋亡模型、分化或增殖变化显著等场景中，优先采用总蛋白归一化，有助于降低传统内参波动带来的系统误差。

附录E 经典通路与推荐检测指标

E1 使用说明

（1）核心蛋白：优先用于回答“通路是否激活”或“关键事件是否发生”。
（2）次核心蛋白：用于补充上下游证据，增强机制链条完整性。
（3）下游 mRNA：指通路下游常用转录读出，常用于 qPCR 配套验证。

E2 常见通路与推荐指标

E2.1 PI3K–AKT 通路

（1）核心蛋白：p-AKT1/AKT2/AKT3（Thr308/Ser473）、AKT1/AKT2/AKT3
（2）次核心蛋白：PIK3CA/PIK3CB/PIK3CD/PIK3CG、PTEN、PDPK1（PDK1）
（3）下游 mRNA：CCND1、BCL2L1、SREBF1

E2.2 mTOR 通路

（1）核心蛋白：p-MTOR（Ser2448）、MTOR
（2）次核心蛋白：RPTOR（Raptor）、RICTOR、p-RPS6KB1（p70S6K1）（Thr389）
（3）下游 mRNA：SREBF1、HIF1A、MYC

E2.3 MAPK/ERK 通路

（1）核心蛋白：p-MAPK1/ERK2 与 p-MAPK3/ERK1（Thr202/Tyr204）、MAPK1/MAPK3
（2）次核心蛋白：p-MAP2K1（MEK1）/MAP2K2（MEK2）（Ser217/221）、BRAF/RAF1
（3）下游 mRNA：FOS、EGR1、DUSP6

E2.4 JAK–STAT 通路

（1）核心蛋白：p-STAT1（Tyr701）、p-STAT3（Tyr705）、p-STAT5A/STAT5B（Tyr694/699）
（2）次核心蛋白：JAK1/JAK2/JAK3、TYK2、SOCS3
（3）下游 mRNA：SOCS3、CISH、ISG15

E2.5 NF-κB 通路

（1）核心蛋白：p-RELA（p65）（Ser536）、RELA
（2）次核心蛋白：NFKBIA（IκBα）/p-NFKBIA（Ser32/36）、IKBKB（IKKβ）
（3）下游 mRNA：NFKBIA、TNFA、IL6

E2.6 TGF-β 通路

（1）核心蛋白：p-SMAD2（Ser465/467）、SMAD2；p-SMAD3（Ser423/425）、SMAD3
（2）次核心蛋白：SMAD4、TGFBR1/TGFBR2
（3）下游 mRNA：SERPINE1、COL1A1、ACTA2

E2.7 Wnt/β-catenin 通路

（1）核心蛋白：CTNNB1、non-phospho active β-catenin
（2）次核心蛋白：GSK3B/p-GSK3β（Ser9）、DVL2/DVL3
（3）下游 mRNA：AXIN2、MYC、CCND1

E2.8 p53 通路

（1）核心蛋白：TP53、CDKN1A（p21）
（2）次核心蛋白：MDM2、BBC3（PUMA）
（3）下游 mRNA：CDKN1A、MDM2、BBC3

E2.9 凋亡通路

（1）核心蛋白：cleaved-CASP3（Asp175）、cleaved-PARP1（Asp214）
（2）次核心蛋白：BAX、BCL2、cleaved-CASP8
（3）下游 mRNA：BAX、BCL2L11、PMAIP1

E2.10 自噬通路

（1）核心蛋白：MAP1LC3B（LC3B I/II）、SQSTM1（p62）
（2）次核心蛋白：BECN1、ATG5、ULK1
（3）下游 mRNA：SQSTM1、BECN1、ATG5

E2.11 铁死亡通路

（1）核心蛋白：GPX4、SLC7A11（xCT）
（2）次核心蛋白：ACSL4、FTH1
（3）下游 mRNA：PTGS2、SLC7A11、HMOX1

E2.12 DNA 损伤应答相关模块

（1）γH2AX 模块
核心蛋白：p-H2AFX（γH2AX）（Ser139）、H2AFX
次核心蛋白：TP53、p-TP53（Ser15）
下游 mRNA：CDKN1A、GADD45A、BBC3

（2）ATM–CHK2 分支
核心蛋白：p-ATM（Ser1981）、ATM；p-CHEK2（Thr68）、CHEK2
次核心蛋白：p-TP53（Ser15）、TP53
下游 mRNA：CDKN1A、GADD45A、MDM2

（3）ATR–CHK1 分支
核心蛋白：p-CHEK1（Ser345）、CHEK1
次核心蛋白：ATR、WEE1
下游 mRNA：WEE1、CDKN1A、GADD45A

E2.13 EMT 经典指标模块

（1）核心蛋白：CDH1（E-cadherin）、VIM（Vimentin）
（2）次核心蛋白：SNAI1（Snail）、ZEB1
（3）下游 mRNA：CDH1、VIM、SNAI1

E2.14 激酶激活即刻早期基因读出模块

（1）核心蛋白：p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）、ERK1/2
（2）次核心蛋白：p-CREB1（Ser133）、CREB1
（3）下游 mRNA：FOS、JUN、EGR1

E2.15 说明

实际项目中，推荐检测指标应结合研究方向、样本类型、处理条件、目标通路层级及现有文献证据综合确定。若涉及磷酸化、切割体、核转位、膜定位或低丰度蛋白，建议在项目评估阶段提前确认检测组合与归一化策略。

案例