胶质母细胞瘤 / 高级别胶质瘤动物实验研究用户指南

第一章 指南总览

胶质母细胞瘤 / 高级别胶质瘤（GBM/HGG）动物模型的选择，不能只按“皮下、原位、转移”进行技术性分类，更应围绕血脑屏障、脑内微环境、局部浸润、术后复发、脑水肿、神经功能损伤以及免疫抑制这几个真正决定临床转化成败的维度进行组合式选型。与大多数实体瘤不同，GBM/HGG 的主要临床问题并不是远处转移，而是脑内局部浸润、复发和治疗抵抗，因此一套真正有价值的模型体系，核心不在“有没有皮下模型”，而在“是否尽早进入颅内原位与复发模型”。

从研发决策路径看，皮下异种移植模型更适合早期药效、剂量探索和 PK/PD；颅内原位模型更适合回答 BBB 穿透、脑内分布、局部侵袭、脑水肿和真实生存获益；切除后复发模型是最接近临床诊疗路径的核心平台，特别适用于术后辅助治疗、局部残留病灶和复发抑制研究；同种免疫完整模型则是免疫治疗、溶瘤病毒、放疗联合和 TME 重塑研究的高优先级系统；人源化模型适合回答双抗、TCE、CAR-T/NK 等依赖人免疫系统的问题。因此，GBM/HGG 项目更适合采用“皮下早筛—颅内原位验证—切除后复发深化—免疫确认”的递进式模型路线，而不是停留在单一皮下缩瘤结果。

第二章 细胞系库与分子分层特征

2.1 标准人源胶质瘤细胞系

标准人源胶质瘤细胞系中，U87MG、U251、LN229、T98G 仍然是使用频率最高的一组基础模型。U87MG 的特点是成瘤稳定、重复性高、皮下与颅内原位均容易建立，适合早期药效和 PK/PD 评价；U251 常用于 DNA 损伤、放疗联合和迁移相关研究；LN229 适合 p53 相关、DNA 损伤修复和联合用药研究；T98G 更常用于 MGMT 表达、替莫唑胺耐药和放疗耐受研究。对于处于候选药物初筛阶段的项目，这类标准株仍然是最容易标准化管理的一组工具细胞。

2.2 干细胞样 / 高侵袭模型

与传统贴壁细胞相比，患者来源的胶质瘤干细胞样球体模型，如 GSC11、GSC23 以及其他 GSC 系列，在侵袭性、肿瘤异质性、放疗后残留细胞生存能力和复发模拟方面明显更接近临床真实状态。尤其在颅内原位条件下，这类模型更容易形成弥漫性浸润边界、微血管增生和坏死样区域，因此对于研究复发、侵袭、耐药和脑内微环境的项目，其优先级通常高于 U87MG 等标准株。若项目定位明确偏向临床转化，应优先使用至少一个 GSC 模型并与标准株并行，而不建议只依赖传统贴壁细胞。

2.3 同种免疫完整模型代表株

同种免疫完整平台中，GL261 和 CT-2A 是最常用的两类基础模型，通常用于 C57BL/6 背景。GL261 应用最广，适合免疫检查点、放疗联合、溶瘤病毒、TME 重塑和单细胞分析；CT-2A 更偏向高侵袭、免疫抑制和更具恶性表型的研究场景。对于 IO 项目，尤其是 PD-1/PD-L1、CTLA-4、STING、细胞因子和局部免疫激活方向，不建议停留在同种皮下模型，而应尽早进入同种颅内原位模型。

第三章 皮下异种移植模型（CDX）

皮下 CDX 模型是 GBM/HGG 最基础、最稳定的早期药效平台，适合药效 PoC、剂量探索、PK/PD 关系建立以及不同候选药物的横向排序。其优势是操作标准化、成瘤一致性较高、成本较低、便于高频率量尺监测，因此对于小分子、细胞毒药、早期 ADC、纳米递送系统和局部释放制剂的第一轮筛选非常有价值。

但皮下模型的局限同样非常明确，即它几乎无法反映 BBB、脑内药物分布、局部侵袭、脑水肿、神经功能影响和微环境相关耐药，因此对于任何涉及 BBB 穿透、局部给药、放疗、免疫治疗、溶瘤病毒或复发抑制的项目，皮下模型都只能作为起点，而不能作为主要决策平台。

3.1 标准皮下 CDX 模型

U87MG、U251、LN229、T98G+BALB/c nude 或 NSG 小鼠

常规接种量为 1×10^6–5×10^6 个细胞，皮下接种于右侧背部或腋下 flank，当肿瘤达到约 80–150 mm³ 时随机分组。治疗周期通常为 2–4 周，若研究耐药、撤药再挑战或缓释制剂的持续作用，可延长至 4–8 周。

检测指标： TGI、RTV、终末瘤重、体重和组织学机制终点，后者常包括 Ki67、cleaved caspase-3、γH2AX、pAKT、pERK 以及药物组织分布。

阳性药：替莫唑胺仍是最常用的标准对照；若项目需要模拟标准治疗路径，可增加放疗联合替莫唑胺；若项目关注血管生成、水肿或脑肿瘤相关血管信号，可将贝伐珠单抗作为机制性参考对照。对于 PI3K/AKT/mTOR 方向，可增加 paxalisib 一类在研药物作为前沿研发参照，但不宜将其表述为标准上市对照。

第四章 颅内原位模型

颅内原位模型是 GBM/HGG 项目中最关键、最具转化意义的高优先级平台。与皮下模型相比，它能够更真实地反映 BBB 限制、脑内分布、肿瘤在白质束和脑实质中的浸润、生长边界不清、局部脑水肿以及神经系统症状负荷，因此对绝大多数脑肿瘤项目而言，原位模型都不只是“升级验证”，而是决定项目是否真正有临床外推价值的核心环节。

4.1 人源颅内原位模型

U87MG-luc、U251-luc、LN229-luc、T98G-luc，以及 GSC11-luc、GSC23-luc 等 GSC 球体模型+裸鼠、NOD-SCID、NSG 或 NOG

常规操作中，需先完成麻醉和头部固定，再行头皮正中切口、暴露前囟与后囟，并校准头部水平。多数实验室采用立体定位在纹状体区域建模，常用坐标范围是以前囟为参考点，前后位后移约 0.5–1.0 mm，左右位旁开 1.5–2.5 mm，深度约 2.5–3.5 mm。之所以说是范围，而不是单一坐标，是因为不同鼠龄、品系、细胞体积和靶区会影响最终设定；在实际 SOP 中，必须先固定一个团队内部统一坐标方案，避免批次间漂移。钻孔后通常使用 Hamilton 微量注射器或玻璃毛细针注射 2–5 μL 细胞悬液，细胞量多在 1×10^5–5×10^5 个之间；注射速度建议控制在约 0.5–1 μL/min，注射完成后应保针 2–5 min，再缓慢退出针头，以减少返流和脑表面播散。

原位模型建立后，给药起始时间不能简单沿用皮下模型的“体积达标”逻辑，而应依据成像或预设生长曲线确定。若使用 luc 标记株，通常在造模后 3–7 天做首次 IVIS，以确认成瘤和建立基线；若用 MRI 作为主监测工具，则可在第 7–14 天完成首次基线扫描。

给药窗口一般分为三种：第一种是早期干预，适用于 BBB 穿透、小分子和局部递药研究；第二种是影像阳性后干预，适用于模拟临床“确诊后起始治疗”；第三种是神经症状出现前中期干预，适用于生存获益研究。常规治疗周期为 2–6 周，但脑内模型的真正核心终点通常不是短期体积变化，而是生存、影像进展延迟和神经功能维持。

该模型的核心检测指标包括：MRI 或 IVIS 肿瘤负荷、生存、神经行为学评分、脑水肿程度、BBB 渗透性变化以及病理学终点。IHC 常见指标包括 GFAP、Nestin、Ki67、CD31、Iba1、CD8、FoxP3；若项目涉及药物分布，还应增加脑内浓度、肿瘤边缘与核心分布比值以及正常脑组织暴露。对于 GSC 模型，还建议增加 SOX2、OLIG2、CD133 或其他干性相关指标。若项目定位为 BBB 穿透或脑内暴露优化，则原位模型的脑组织药代数据应作为与生存同等重要的终点，而不能只看 IVIS 信号下降。

4.2 同种原位模型

GL261-luc 和 CT-2A-luc 在 C57BL/6 小鼠中的颅内原位模型，是 GBM/HGG 免疫研究中最重要的平台之一。

其造模方式与人源原位模型基本一致，但细胞量通常略低，常见范围为 5×10^4–2×10^5 个，以避免肿瘤过快生长导致治疗窗口过短。同种原位模型最大的价值在于同时保留脑内器官环境和完整免疫系统，因此适合 PD-1/PD-L1、CTLA-4、溶瘤病毒、STING、细胞因子、树突状细胞疫苗、CAR-T/NK 和放疗联合等方向。需要强调的是，对于这类模型，体积或 BLI 并不能完全代表治疗效果，因为免疫治疗可能出现伪进展，因此必须把生存放在更高权重位置，并辅以流式、单细胞、空间转录组或免疫组化评估免疫浸润和髓系细胞状态。

原位同种模型中，给药起始应较皮下模型更早，很多情况下在原位造模后 4–7 天、BLI 刚出现稳定信号时即启动治疗。若是放疗联合，可先在 MRI/BLI 确认可测病灶后进行局部照射，再开展联合用药。对于溶瘤病毒或脑内局部给药系统，应明确注射路径是肿瘤内、瘤周还是脑室旁注射，并在设计中把返流控制、注射速度和局部神经毒性作为关键技术参数。

第五章 复发与微小残留病灶模型

GBM/HGG 的临床核心问题是术后复发，因此复发模型在这一适应症中的地位远高于多数实体瘤。若一个项目定位明确是术后辅助治疗、局部递药、放疗增敏、微小残留病灶清除或复发延缓，而实验体系中没有切除后复发模型，则其临床外推价值通常是不充分的。

5.1 切除后复发模型

常用模型包括 GL261-luc、CT-2A-luc、U87MG-luc，以及各类 GSC-luc 颅内原位模型。

常规路径是：先建立颅内原位瘤，并通过 IVIS 或 MRI 确认肿瘤达到可切除窗口，然后进行开颅减瘤或部分切除，最后在术后给予局部或系统治疗并随访复发。切除时通常不会追求“全切”，因为小鼠模型中更常见、也更可重复的做法是保留微小残余病灶，以模拟临床术后残留。实际操作中，可采用显微镜下自由手切除、荧光引导切除、活检冲切样减瘤，或 MRI 引导切除等不同方式。

切除后复发模型的给药设计应比未切除原位模型更接近临床节奏。最常见的三类方案为：第一，术后 24–72 h 启动治疗，模拟早期辅助治疗；第二，术后联合放疗再加药物，模拟 Stupp 路径的扩展；第三，术后待复发影像信号出现后再启动，模拟复发治疗。该模型的核心终点包括：复发时间、无进展生存、总生存、复发灶体积、复发灶边界浸润程度以及局部免疫环境变化。若项目涉及局部缓释、植入物或放射性局部制剂，必须在切除腔模型中验证，而不能仅在未切除原位瘤中外推。

5.2 放疗后残留与再挑战模型

除直接手术切除模型外，还可采用放疗诱导残留病灶的方式构建“治疗后残留—再生长”模型。这类设计适用于放疗增敏剂、放疗后维持治疗和复发抑制药物研究。常规做法是在颅内原位模型出现稳定影像后给予局部放疗，可采用单次较高剂量或分割放疗，然后在放疗后 24–72 h 或 5–7 天内启动药物治疗，再观察信号下降后的再增长速度。该模型尤其适合比较“抑制原发增长”与“抑制再增长”是否为同一类机制。

第六章 同种免疫完整模型

同种免疫完整模型在 GBM/HGG 中的价值非常高，因为脑肿瘤天然具有髓系细胞富集、T 细胞活化不足、小胶质细胞参与和局部免疫抑制显著等特点。若只使用异种移植模型，通常会低估免疫微环境、BBB 及脑实质先天免疫系统对治疗效果的影响。因此，对于 IO、溶瘤病毒、细胞治疗和放疗联合项目，同种模型不是“可选项”，而是关键验证步骤。

6.1 同种皮下模型

GL261 或 CT-2A 皮下模型适合免疫项目早期筛选，尤其用于 PD-1、CTLA-4、STING、细胞因子、局部免疫激动剂和联合治疗方案的第一轮排序。其优势是便于体积测量、取材方便、批间差异较小；其局限是没有 BBB，也没有脑实质微环境，因此只能回答“在完整免疫系统存在下，药物是否有基础免疫活性”，而不能回答“在脑内环境中是否仍成立”。在皮下同种模型中，治疗通常应更早起始，常见为 50–80 mm³ 即开始，以覆盖 2–3 个免疫循环窗口。核心指标包括体积、生存、体重、流式免疫分型、细胞因子、IHC/空间免疫等。

6.2 同种原位模型

GL261-luc 或 CT-2A-luc 原位模型是 GBM/HGG 免疫项目的真正高优先级平台。其优势在于同时具备完整免疫系统和脑内器官环境，能够更真实地评估 PD-1/PD-L1、CTLA-4、放疗联合、溶瘤病毒、CAR-T/NK、局部给药及 TME 重塑的效果。该模型中，体积变化并不是唯一终点，真正重要的是生存获益、免疫浸润结构变化、小胶质/巨噬细胞极化、髓系抑制缓解以及复发延迟。若项目涉及单细胞或空间组学研究，同种原位模型优先级远高于皮下同种模型。

第七章 人源化免疫模型

人源化模型主要用于回答那些普通异种模型和同种模型都无法充分回答的问题，尤其是双抗、TCE、CAR-T、CAR-NK、人源细胞因子及其他依赖人免疫系统效应的项目。对于 GBM/HGG 来说，这类模型并不适合做高通量早筛，而更适合作为关键节点验证与机制确认平台。

7.1 huPBMC + 人源 GBM 模型

huPBMC 模型适合短周期免疫验证，常与 U87MG、GSC11、GSC23 等模型联合使用。其优势是建模快，通常可以在较短时间内完成双抗、TCE、CAR-T/NK 或抗体依赖免疫杀伤验证；其局限是 xGvHD 风险较高，观察窗口相对较短，因此更适合 2–4 周内的实验设计，而不适合长期复发或长期维持治疗研究。若项目主要关注细胞因子释放、早期免疫激活和脑内局部毒性风险，该模型具有较高价值。

7.2 huHSC / BLT + 人源 GBM 模型

huHSC 或 BLT 人源化模型更适合长周期人免疫重建、复杂联合和微环境机制研究。与 huPBMC 相比，这类模型的人免疫系统更完整，更适合研究持续性免疫应答、髓系细胞参与、T 细胞耗竭和耐药演化。对于患者来源 GSC 模型，这类体系尤其有助于保留原始肿瘤异质性和更真实的人免疫背景，但其成本高、周期长、供者差异大，因此更适合作为后期确认平台，而不适合作为第一轮筛选工具。

第八章 项目升级路径建议

8.1 小分子 / ADC / BBB 渗透项目

建议路径为：U87MG、LN229、T98G 或 GSC 皮下 CDX 早筛 → 人源颅内原位模型验证 BBB 穿透和脑内暴露 → 必要时进入切除后复发模型。对于这类项目，皮下缩瘤结果最多只能说明药物有基础肿瘤抑制能力，真正决定是否可继续推进的，往往是脑内药代、肿瘤核心/边缘暴露和原位生存获益。

8.2 免疫治疗项目

建议路径为：GL261 或 CT-2A 同种皮下模型早筛 → GL261-luc 或 CT-2A-luc 同种原位模型验证 → 必要时进入人源化模型。若项目涉及双抗、CAR-T/NK 或强依赖人免疫系统的机制，则在原位同种模型命中后应尽快进入 huPBMC 或 huHSC 模型，而不应直接从皮下异种模型外推。

8.3 放疗 / 局部治疗 / 植入物项目

建议路径为：人源或同种颅内原位模型优先 → 必要时叠加切除后复发模型。对于放疗增敏、局部药物缓释、切除腔内植入物、局部放射性制剂或瘤内注射项目，未切除原位模型可以作为第一步，但真正的决策平台通常应是切除后复发模型，因为这更接近临床实际使用场景。

8.4 复发项目

建议路径为：颅内原位建模 → 影像确认 → 手术减瘤或局部放疗 → 术后 / 放疗后维持干预 → 长程随访。GBM/HGG 的复发研究不建议用单纯“晚期原位模型延长观察”替代切除后复发模型，因为两者在残留病灶结构、局部炎症状态和药物进入条件上有本质差异。

第九章 检测指标与阳性药体系

9.1 通用检测指标

GBM/HGG 模型的核心终点不应只停留在肿瘤负荷，而应同时覆盖影像、生存、神经功能和组织学。皮下模型以 TGI、RTV、体重和终末瘤重为核心；原位模型和复发模型则以生存为最高优先级，并辅以 MRI/IVIS、神经行为学、脑水肿、BBB 渗透性和病理。机制终点通常包括 GFAP、Nestin、Ki67、CD31、Iba1、CD8、FoxP3、SOX2、OLIG2，以及在需要时加入单细胞、流式、TCR 谱、空间转录组和脑内药物浓度分析。

9.2 阳性药推荐

标准治疗对照仍以替莫唑胺为核心，必要时加入放疗联合 TMZ 模拟标准治疗路径；若项目涉及血管生成、水肿控制或 MRI 反应评估，可加入贝伐珠单抗作为机制性对照。前沿研发参考方面，paxalisib 适用于 PI3K/AKT/mTOR 方向研究，dordaviprone / ONC201 更偏向弥漫中线胶质瘤 / H3 K27M 场景，但也可作为脑肿瘤方向的前沿机制参考，rhenium obisbemeda / 186RNL 则更适合局部放射性递送与复发模型研究。需要注意的是，这些前沿药物更适合作为研发参考，而不是统一意义上的标准上市阳性药。

第十章 优势与局限

皮下 CDX 的优势在于最标准化、最适合高通量早筛和 PK/PD，但其对 BBB、脑内微环境、复发和局部侵袭几乎没有外推能力。
颅内原位模型 的优势在于最接近临床脑肿瘤状态，特别适合 BBB 穿透、脑内分布、侵袭、生存和脑水肿研究，但建模技术要求高、批间差异更大。
切除后复发模型 的优势在于转化价值最高，特别适合术后辅助治疗、局部给药和复发抑制研究，但手术复杂、死亡率和变异更高，对团队手术一致性要求很高。
同种免疫完整模型 的优势在于可评估完整免疫系统和 TME 重塑，特别适合 IO、放疗联合和溶瘤病毒项目；其局限是鼠源肿瘤与人瘤仍存在生物学差异。
人源化模型 的优势在于最适合验证人免疫依赖机制，尤其适用于双抗、TCE 和细胞治疗；其局限是成本高、供者差异大、xGvHD 风险明显、实验窗口相对有限。

胶质母细胞瘤 / 高级别胶质瘤模型体系的关键，不在于模型数量，而在于是否真正围绕“脑内环境、BBB 与复发”构建路径。对早期小分子、ADC 和纳米药项目，皮下模型足以完成第一轮筛选；但对绝大多数具有转化目标的项目，必须进入颅内原位模型验证脑内暴露和生存获益；对术后辅助治疗、局部递药和复发抑制项目，则应进一步进入切除后复发模型；对免疫治疗项目，应坚持“同种原位优先于同种皮下”，必要时再进入人源化体系。整体建议采用“皮下早筛—原位验证—复发深化—免疫确认”的递进式模型路线，以提高模型结果对 GBM/HGG 临床开发的支持价值。