胶质母细胞瘤 / 高级别胶质瘤动物实验研究用户指南

导读

一、指南总览
二、细胞系库与分子分层特征
三、皮下异种移植模型（CDX）
四、颅内原位模型
五、复发与微小残留病灶模型
六、同种免疫完整模型
七、人源化免疫模型
八、项目升级路径建议
九、检测指标与阳性药体系
十、优势与局限

一、指南总览

胶质母细胞瘤 / 高级别胶质瘤（GBM/HGG）动物模型的选择，不宜仅按“皮下、原位、转移”进行技术分类，更应围绕血脑屏障、脑内微环境、局部浸润、术后复发、脑水肿、神经功能损伤以及免疫抑制等决定临床转化成败的关键维度开展组合式选型。与多数实体瘤相比，GBM/HGG 的主要临床问题集中在脑内局部浸润、复发和治疗抵抗，因此，真正具有研究价值的模型体系，重点应放在尽早进入颅内原位模型与复发模型，而非停留在单一皮下模型层面。

从研发决策路径看，皮下异种移植模型更适用于早期药效评价、剂量探索以及药代/药效关系研究；颅内原位模型更适用于评估血脑屏障穿透、脑内分布、局部侵袭、脑水肿和真实生存获益；切除后复发模型最接近临床诊疗路径，尤其适用于术后辅助治疗、局部残留病灶和复发抑制研究；同种免疫完整模型是免疫治疗、溶瘤病毒、放疗联合及肿瘤微环境重塑研究中的高优先级平台；人源化模型则更适合回答双抗、T 细胞衔接器（TCE）、CAR-T/NK 等依赖人免疫系统的问题。因此，GBM/HGG 项目更适合采用“皮下早筛—颅内原位验证—切除后复发深化—免疫确认”的递进式模型路线，以避免仅依据单一皮下缩瘤结果作出研发判断。

二、细胞系库与分子分层特征

2.1 标准人源胶质瘤细胞系

标准人源胶质瘤细胞系中，U87MG、U251、LN229、T98G 仍是使用频率较高的一组基础模型。U87MG 具有成瘤稳定、重复性高的特点，皮下与颅内原位模型均较易建立，适合早期药效评价及药代/药效研究；U251 常用于 DNA 损伤、放疗联合及迁移相关研究；LN229 适合 p53 相关、DNA 损伤修复及联合用药研究；T98G 更常用于 MGMT 表达、替莫唑胺耐药和放疗耐受研究。对于处于候选药物初筛阶段的项目，这类标准细胞株便于标准化管理，是较为稳妥的工具型模型。

2.2 干细胞样 / 高侵袭模型

与传统贴壁细胞相比，患者来源的胶质瘤干细胞样球体模型，如 GSC11、GSC23 及其他 GSC 系列，在侵袭性、肿瘤异质性、放疗后残留细胞存活能力和复发模拟方面更接近临床实际状态。尤其在颅内原位条件下，这类模型更容易形成弥漫性浸润边界、微血管增生和坏死样区域。因此，对于研究复发、侵袭、耐药和脑内微环境的项目，这类模型的优先级通常高于 U87MG 等标准细胞株。若项目定位偏向临床转化，建议至少引入一个 GSC 模型与标准株并行使用，避免仅依赖传统贴壁细胞。

2.3 同种免疫完整模型代表株

在同种免疫完整平台中，GL261 和 CT-2A 是最常用的基础模型，通常应用于 C57BL/6 背景小鼠。GL261 应用范围广，适用于免疫检查点抑制、放疗联合、溶瘤病毒、肿瘤微环境重塑和单细胞分析；CT-2A 更适合高侵袭、免疫抑制及恶性表型更突出的研究场景。对于免疫治疗项目，尤其是 PD-1/PD-L1、CTLA-4、STING、细胞因子及局部免疫激活方向，建议尽早进入同种颅内原位模型，而不宜长期停留在同种皮下模型阶段。

三、皮下异种移植模型（CDX）

皮下 CDX 模型是 GBM/HGG 最基础、最稳定的早期药效平台，适合药效验证、剂量探索、药代/药效关系建立及不同候选药物的横向排序。该模型具有操作标准化、成瘤一致性较高、成本相对较低、便于高频量尺监测等优势，因此，对于小分子、细胞毒药物、早期 ADC、纳米递送系统和局部释放制剂的首轮筛选具有较高价值。

不过，皮下模型难以反映血脑屏障、脑内药物分布、局部侵袭、脑水肿、神经功能影响以及微环境相关耐药等关键问题。因此，凡涉及血脑屏障穿透、局部给药、放疗、免疫治疗、溶瘤病毒或复发抑制的项目，皮下模型更适合作为起始平台，难以承担核心决策功能。

3.1 标准皮下 CDX 模型

常用组合包括 U87MG、U251、LN229、T98G 联合 BALB/c nude 或 NSG 小鼠。常规接种量为 1×10^6–5×10^6 个细胞，接种部位通常选择右侧背部或腋下侧腹部。当肿瘤体积达到约 80–150 mm³ 时进行随机分组。治疗周期一般为 2–4 周；若研究耐药、停药后再挑战或缓释制剂持续作用，可延长至 4–8 周。

检测指标通常包括肿瘤生长抑制率（TGI）、相对肿瘤体积（RTV）、终末瘤重、体重及组织学机制终点。常见组织学指标包括 Ki67、cleaved caspase-3、γH2AX、pAKT、pERK 以及药物组织分布。

阳性对照药方面，替莫唑胺仍是最常用的标准对照；若项目需要模拟标准治疗路径，可设置放疗联合替莫唑胺；若项目关注血管生成、水肿或脑肿瘤相关血管信号，可将贝伐珠单抗作为机制参考对照。对于 PI3K/AKT/mTOR 方向，可增加 paxalisib 类在研药物作为前沿研发参考，但更适合定位为研发参照，而非标准上市对照。

四、颅内原位模型

颅内原位模型是 GBM/HGG 项目中最具转化意义的高优先级平台。与皮下模型相比，该模型能够更真实地反映血脑屏障限制、脑内分布、肿瘤在白质束和脑实质中的浸润、生长边界不清、局部脑水肿以及神经系统症状负荷。因此，对于大多数脑肿瘤项目而言，原位模型是决定项目是否具备临床外推价值的关键环节。

4.1 人源颅内原位模型

常用模型包括 U87MG-luc、U251-luc、LN229-luc、T98G-luc，以及 GSC11-luc、GSC23-luc 等 GSC 球体模型，常配合裸鼠、NOD-SCID、NSG 或 NOG 小鼠使用。

常规操作中，需先完成麻醉和头部固定，再行头皮正中切口，暴露前囟与后囟，并校准头部水平。多数实验室采用立体定位在纹状体区域建模，常用坐标范围为以前囟为参考点，前后位后移约 0.5–1.0 mm，左右位旁开 1.5–2.5 mm，深度约 2.5–3.5 mm。由于不同鼠龄、品系、细胞体积和靶区会影响最终设定，因此实际标准操作流程中应固定团队内部统一坐标方案，以减少批次间漂移。钻孔后通常使用 Hamilton 微量注射器或玻璃毛细针注射 2–5 μL 细胞悬液，细胞量多为 1×10^5–5×10^5 个；注射速度建议控制在约 0.5–1 μL/min。注射完成后应保针 2–5 分钟，再缓慢退出针头，以降低返流和脑表面播散风险。

原位模型建立后，给药起始时间不宜直接沿用皮下模型按“体积达标”启动的逻辑，而应依据成像结果或预设生长曲线确定。若使用荧光素酶标记细胞株，通常在造模后 3–7 天进行首次活体成像，以确认成瘤并建立基线；若使用 MRI 作为主要监测工具，则可在第 7–14 天完成首次基线扫描。

给药窗口通常包括三类：一是早期干预，适用于血脑屏障穿透、小分子和局部递药研究；二是在影像阳性后干预，适用于模拟临床确诊后起始治疗；三是在神经症状出现前的中期干预，适用于生存获益研究。常规治疗周期多为 2–6 周，但脑内模型更关注的核心终点通常是生存、影像进展延迟及神经功能维持，而非短期体积变化。

该模型的核心检测指标包括 MRI 或活体成像的肿瘤负荷、生存、神经行为学评分、脑水肿程度、血脑屏障通透性变化以及病理学终点。免疫组化常见指标包括 GFAP、Nestin、Ki67、CD31、Iba1、CD8、FoxP3。若项目涉及药物分布，还应检测脑内浓度、肿瘤边缘与核心的分布比值以及正常脑组织暴露。对于 GSC 模型，建议进一步增加 SOX2、OLIG2、CD133 等干性相关指标。若项目重点为血脑屏障穿透或脑内暴露优化，则原位模型中的脑组织药代数据应与生存终点具有同等重要性。

4.2 同种原位模型

GL261-luc 和 CT-2A-luc 在 C57BL/6 小鼠中的颅内原位模型，是 GBM/HGG 免疫研究中极为重要的平台。其造模方式与人源原位模型基本一致，但细胞量通常略低，常见范围为 5×10^4–2×10^5 个，以避免肿瘤生长过快导致治疗窗口过短。

同种原位模型的主要价值在于同时保留脑内器官环境和完整免疫系统，因此适用于 PD-1/PD-L1、CTLA-4、溶瘤病毒、STING、细胞因子、树突状细胞疫苗、CAR-T/NK 以及放疗联合等研究方向。对于这类模型，肿瘤体积或活体成像信号并不能完全代表治疗效果，因为免疫治疗过程中可能出现伪进展，因此更应提高生存终点的权重，并结合流式细胞术、单细胞测序、空间转录组或免疫组化，评估免疫浸润及髓系细胞状态。

在原位同种模型中，给药起始时间通常早于皮下模型。很多情况下，可在原位造模后 4–7 天、活体成像刚出现稳定信号时启动治疗。若为放疗联合，可在 MRI 或活体成像确认可测病灶后进行局部照射，再开展联合给药。对于溶瘤病毒或脑内局部给药系统，应明确注射路径为肿瘤内、瘤周或脑室旁注射，并将返流控制、注射速度及局部神经毒性纳入关键技术参数。

五、复发与微小残留病灶模型

GBM/HGG 的临床核心问题在于术后复发，因此复发模型在该适应症中的研究地位高于多数实体瘤。若项目定位于术后辅助治疗、局部递药、放疗增敏、微小残留病灶清除或复发延缓，而实验体系中缺少切除后复发模型，则其临床外推价值往往有限。

5.1 切除后复发模型

常用模型包括 GL261-luc、CT-2A-luc、U87MG-luc 以及各类 GSC-luc 颅内原位模型。常规研究路径为：先建立颅内原位肿瘤，并通过活体成像或 MRI 确认肿瘤达到可切除窗口；随后进行开颅减瘤或部分切除；最后在术后给予局部或系统治疗，并持续随访复发情况。

切除时通常不追求“全切”，因为在小鼠模型中，更常见且重复性更好的做法是保留微小残余病灶，以模拟临床术后残留状态。实际操作中，可采用显微镜下自由手切除、荧光引导切除、活检冲切样减瘤或 MRI 引导切除等不同方式。

切除后复发模型的给药设计应更贴近临床节奏。常见方案包括：术后 24–72 小时启动治疗，用于模拟早期辅助治疗；术后联合放疗再加药物，用于模拟 Stupp 路径的扩展方案；术后待复发影像信号出现后再启动治疗，用于模拟复发期干预。该模型的核心终点包括复发时间、无进展生存期、总生存期、复发灶体积、复发灶边界浸润程度以及局部免疫环境变化。若项目涉及局部缓释、植入物或放射性局部制剂，应在切除腔模型中完成验证，以确保研究场景与临床应用一致。

5.2 放疗后残留与再挑战模型

除直接手术切除模型外，还可通过放疗诱导残留病灶，构建“治疗后残留—再生长”模型。该设计适用于放疗增敏剂、放疗后维持治疗和复发抑制药物研究。常规做法是在颅内原位模型出现稳定影像后给予局部放疗，可采用单次较高剂量或分割放疗；随后在放疗后 24–72 小时或 5–7 天内启动药物治疗，再观察信号下降后的再增长速度。该模型尤其适合比较“抑制原发增长”与“抑制再增长”是否对应相同机制。

六、同种免疫完整模型

同种免疫完整模型在 GBM/HGG 研究中的价值较高，因为脑肿瘤天然具有髓系细胞富集、T 细胞活化不足、小胶质细胞参与及局部免疫抑制明显等特点。若仅使用异种移植模型，往往难以充分评估免疫微环境、血脑屏障及脑实质先天免疫系统对治疗效果的影响。因此，对于免疫治疗、溶瘤病毒、细胞治疗和放疗联合项目，同种模型应作为关键验证步骤纳入体系。

6.1 同种皮下模型

GL261 或 CT-2A 皮下模型适合免疫项目早期筛选，尤其适用于 PD-1、CTLA-4、STING、细胞因子、局部免疫激动剂及联合治疗方案的首轮排序。该模型便于体积测量、样本采集便利、批间差异较小；但由于缺少血脑屏障和脑实质微环境，其更适合回答“在完整免疫系统存在下，药物是否具有基础免疫活性”这一问题。

在皮下同种模型中，治疗通常需较早启动，常见起始体积为 50–80 mm³，以覆盖 2–3 个免疫循环窗口。核心指标包括肿瘤体积、生存、体重、流式免疫分型、细胞因子以及免疫组化或空间免疫分析。

6.2 同种原位模型

GL261-luc 或 CT-2A-luc 原位模型是 GBM/HGG 免疫项目的高优先级平台。该模型同时具备完整免疫系统和脑内器官环境，能够更真实地评估 PD-1/PD-L1、CTLA-4、放疗联合、溶瘤病毒、CAR-T/NK、局部给药及肿瘤微环境重塑等治疗策略的效果。

在该模型中，肿瘤体积变化并非唯一终点，更重要的评价维度包括生存获益、免疫浸润结构变化、小胶质细胞/巨噬细胞极化、髓系抑制缓解以及复发延迟。若项目涉及单细胞测序或空间组学研究，同种原位模型的优先级明显高于皮下同种模型。

七、人源化免疫模型

人源化模型主要用于回答普通异种模型和同种模型难以充分解释的问题，尤其适用于双抗、TCE、CAR-T、CAR-NK、人源细胞因子及其他依赖人免疫系统效应的项目。对于 GBM/HGG 而言，这类模型更适合作为关键节点验证与机制确认平台，而不适合承担高通量早筛任务。

7.1 huPBMC + 人源 GBM 模型

huPBMC 模型适合短周期免疫验证，常与 U87MG、GSC11、GSC23 等模型联合使用。该模型建模速度较快，通常可在较短时间内完成双抗、TCE、CAR-T/NK 或抗体依赖免疫杀伤验证；但其局限也较明显，包括异种移植物抗宿主病（xGvHD）风险较高、观察窗口较短。因此，该模型更适合 2–4 周内的实验设计，不适合长期复发或长期维持治疗研究。若项目重点关注细胞因子释放、早期免疫激活和脑内局部毒性风险，该模型具有较高参考价值。

7.2 huHSC / BLT + 人源 GBM 模型

huHSC 或 BLT 人源化模型更适合长周期人免疫重建、复杂联合治疗和微环境机制研究。与 huPBMC 相比，这类模型的人免疫系统更完整，更适合研究持续性免疫应答、髓系细胞参与、T 细胞耗竭及耐药演化。对于患者来源 GSC 模型，这一体系有助于保留原始肿瘤异质性和更真实的人免疫背景。但其成本较高、周期较长、供者差异较大，因此更适合作为后期确认平台，而不宜作为首轮筛选工具。

八、项目升级路径建议

8.1 小分子 / ADC / 血脑屏障穿透项目

建议路径为：U87MG、LN229、T98G 或 GSC 皮下 CDX 早筛，随后进入人源颅内原位模型验证血脑屏障穿透和脑内暴露，必要时进一步进入切除后复发模型。对于这类项目，皮下缩瘤结果主要用于说明药物具有基础肿瘤抑制能力，而真正影响项目推进判断的关键指标，往往是脑内药代、肿瘤核心与边缘暴露以及原位生存获益。

8.2 免疫治疗项目

建议路径为：GL261 或 CT-2A 同种皮下模型早筛，随后进入 GL261-luc 或 CT-2A-luc 同种原位模型验证，必要时进一步进入人源化模型。若项目涉及双抗、CAR-T/NK 或高度依赖人免疫系统的机制，则在原位同种模型获得阳性结果后，应尽快进入 huPBMC 或 huHSC 模型，以提高机制判断的可靠性。

8.3 放疗 / 局部治疗 / 植入物项目

建议优先采用人源或同种颅内原位模型，必要时叠加切除后复发模型。对于放疗增敏、局部药物缓释、切除腔内植入物、局部放射性制剂或瘤内注射项目，未切除原位模型可作为起始步骤，但更贴近临床真实场景的核心决策平台通常仍是切除后复发模型。

8.4 复发项目

建议路径为：颅内原位建模、影像确认、手术减瘤或局部放疗、术后或放疗后维持干预、长程随访。GBM/HGG 的复发研究不宜以单纯延长晚期原位模型观察时间来替代切除后复发模型，因为两者在残留病灶结构、局部炎症状态及药物进入条件方面存在明显差异。

九、检测指标与阳性药体系

9.1 通用检测指标

GBM/HGG 模型的核心终点不宜仅停留在肿瘤负荷层面，而应同时覆盖影像、生存、神经功能和组织学。皮下模型通常以 TGI、RTV、体重和终末瘤重为核心指标；原位模型和复发模型则以生存为最高优先级，并结合 MRI、活体成像、神经行为学、脑水肿、血脑屏障通透性及病理评价。机制终点通常包括 GFAP、Nestin、Ki67、CD31、Iba1、CD8、FoxP3、SOX2、OLIG2，并可根据项目需要增加单细胞测序、流式细胞术、TCR 谱、空间转录组及脑内药物浓度分析。

9.2 阳性药推荐

标准治疗对照仍以替莫唑胺为核心，必要时可加入放疗联合替莫唑胺，以模拟标准治疗路径。若项目涉及血管生成、水肿控制或 MRI 影像反应评估，可加入贝伐珠单抗作为机制性对照。前沿研发参考方面，paxalisib 适用于 PI3K/AKT/mTOR 方向研究，dordaviprone / ONC201 更偏向弥漫中线胶质瘤 / H3 K27M 相关场景，也可作为脑肿瘤方向的前沿机制参考；rhenium obisbemeda / 186RNL 更适合局部放射性递送与复发模型研究。这类前沿药物更适合作为研发参考，而不宜统一视作标准上市阳性药。

十、优势与局限

皮下 CDX 模型的优势在于标准化程度高，适合高通量早筛和药代/药效研究，但对于血脑屏障、脑内微环境、复发和局部侵袭的外推能力有限。

颅内原位模型的优势在于更接近临床脑肿瘤状态，尤其适合血脑屏障穿透、脑内分布、侵袭、生存和脑水肿研究，但建模技术要求较高，批间差异也相对更大。

切除后复发模型的优势在于转化价值突出，尤其适合术后辅助治疗、局部给药和复发抑制研究，但手术复杂、死亡率和变异性相对较高，对团队手术一致性要求较高。

同种免疫完整模型的优势在于可评估完整免疫系统及肿瘤微环境重塑，尤其适合免疫治疗、放疗联合和溶瘤病毒项目；其局限在于鼠源肿瘤与人源肿瘤之间仍存在生物学差异。

人源化模型的优势在于更适合验证人免疫依赖机制，尤其适用于双抗、TCE 和细胞治疗；其局限则包括成本高、供者差异大、xGvHD 风险明显以及实验窗口相对有限。

总体来看，胶质母细胞瘤 / 高级别胶质瘤模型体系的关键，在于是否真正围绕“脑内环境、血脑屏障与复发”建立研究路径。对早期小分子、ADC 和纳米药物项目，皮下模型可用于完成第一轮筛选；对大多数具有转化目标的项目，应进入颅内原位模型验证脑内暴露和生存获益；对术后辅助治疗、局部递药和复发抑制项目，应进一步进入切除后复发模型；对免疫治疗项目，应坚持同种原位模型优先，必要时再进入人源化体系。整体建议采用“皮下早筛—原位验证—复发深化—免疫确认”的递进式模型路线，以提升模型结果对 GBM/HGG 临床开发的支持价值。