南京博恩生物技术有限公司面向高校、科研院所、医药企业与生物技术企业，提供从方案评估、实验设计、样本前处理、核酸提取、逆转录、PCR/qPCR 扩增到结果分析的一站式 PCR 实验外包服务。服务范围覆盖常规 PCR、RT-PCR、RT-qPCR、荧光定量 PCR 基因表达分析、病原体核酸检测、基因分型、拷贝数分析、RNA 干扰验证、药效分子核心指标检测及发表级数据整理。

PCR 本质上是一种核酸扩增技术。常规 PCR 主要用于特定 DNA 片段的扩增与鉴定，qPCR 用于核酸靶标的实时检测与定量，RT-qPCR 则是在 RNA 逆转录为 cDNA 后进行实时定量扩增，因此是科研工作中最常用的 mRNA 表达分析方法之一。公司不仅提供实验执行服务，也提供检测路线判断、方案优化、数据分析与结果解释支持，帮助客户从研究问题出发，选择更合适的实验路径。

导读

一、服务定位与核心优势
二、适用场景与客户类型
三、服务流程
四、样本要求与送样说明
五、交付内容与售后支持
六、周期与报价方式
附录A 实验设计与质量控制
附录B PCR与其他实验方法的选择逻辑
附录C 常见问题
附录D 70个常见通路的PCR下游mRNA推荐清单

一、服务定位与核心优势

1.1 以研究问题为导向，提升技术路线匹配度

南京博恩生物技术有限公司面向高校、科研院所、医药企业与生物技术企业，提供从方案评估、实验设计、样本前处理、核酸提取、逆转录、PCR/qPCR扩增到结果分析的一站式PCR实验外包服务。服务范围覆盖常规PCR、RT-PCR、RT-qPCR、荧光定量PCR基因表达分析、病原体核酸检测、基因分型、拷贝数分析、RNA干扰验证、药效分子核心转录响应指标检测及发表级数据整理。

PCR本质上是一种核酸扩增技术。常规PCR主要用于特定DNA片段的扩增与鉴定，qPCR用于核酸靶标的实时检测与定量，RT-qPCR则是在RNA逆转录为cDNA后进行实时定量扩增，因此是科研工作中最常用的mRNA表达分析方法之一。公司在提供实验执行服务的同时，也提供检测路线判断、方案优化、数据分析与结果解释支持，帮助客户围绕研究问题选择更合适的实验路径。

PCR适用于回答核酸层面的问题，例如目标基因是否存在、目标基因转录水平是否变化、样本中是否检出特定核酸序列、某个位点是否存在分型差异，以及样本拷贝数是否发生变化。对于蛋白表达、蛋白磷酸化、蛋白切割、蛋白定位等研究问题，通常建议采用Western blot、免疫组化、免疫荧光或流式细胞术等更匹配的实验方法。

公司在项目评估阶段会优先判断研究问题是否适合采用PCR/qPCR技术，从而提高项目设计的合理性，减少技术路线偏差带来的执行风险。

1.2 具备完整的方法学设计能力

服务内容覆盖样本类型判断、检测形式确认、参考基因筛选、引物设计策略制定、对照设置、定量方式选择，以及是否区分剪接体或转录本等关键方法学问题。针对不同研究目的，可协助客户明确应采用常规PCR、DNA qPCR还是RT-qPCR，并结合样本类型、物种信息、目标序列特征和实验目的制定相应方案。

1.3 强调过程控制与结果可靠性

PCR/qPCR结果质量高度依赖样本核酸质量、引物特异性、扩增效率、参考基因稳定性和实验对照设置。公司在项目执行中重视核酸质量评估、引物或探针设计与验证、扩增曲线判读、熔解曲线分析及Ct/Cq数据整理，确保实验结果具备解释价值、重复价值和科研使用价值。

1.4 提供从实验数据到科研交付的一体化支持

项目交付内容不仅包括原始扩增数据和结果表格，还包括统计分析图、结果描述、图注说明及完整中文报告。对于需要汇报、论文撰写或项目结题的客户，还可进一步整理发表级图版和配套材料，帮助客户提高结果使用效率。项目完成后持续提供售后支持，包括结果解释、数据整理、图版优化及投稿补充材料准备等服务。

二、适用场景与客户类型

2.1 适用研究场景

本服务适用于基因表达分析、药物刺激前后转录水平比较、炎症因子mRNA检测、信号通路下游转录响应指标检测、病原体核酸检测、基因分型、SNP或等位基因判定、拷贝数分析、RNA干扰验证、细胞模型验证及临床前药效研究等场景。

在科研应用中，常见检测内容包括炎症因子、通路下游基因、分化标志物mRNA、病毒或细菌特异核酸序列、基因多态性位点、相对或绝对拷贝数、siRNA或shRNA敲降后的mRNA变化，以及给药后的靶基因或下游转录响应变化。对于低拷贝靶标或低丰度转录本，也可结合项目情况进行灵敏度和检测策略评估。

2.2 适用客户类型

高校与科研院所客户通常用于课题验证、基因表达检测、基金项目数据补充及论文结果完善。医药企业客户更多聚焦于药效分子核心转录响应指标、靶点转录响应分析、病原体核酸检测及生物标志物研究。生物技术企业客户则常用于产品功能验证、核酸检测开发、批量样本定量分析及模型体系确认。

三、服务流程

3.1 方案提交

客户提交研究目的、检测基因、样本类型、物种信息、分组设计、处理条件、参考文献及其他相关背景资料。若项目涉及剪接体区分、转录本差异分析或特殊检测目的，也建议在此阶段一并说明。

3.2 方案评估

公司对项目需求进行技术评估，重点判断检测目标是否适合采用PCR/qPCR方法，并明确实验类型、样本要求、参考基因选择思路、引物设计策略和定量路径。

3.3 问题反馈与优化

对于方案中可能存在的风险或不合理之处，公司将进行反馈并提出优化建议。例如，部分目标问题更适合蛋白层面实验，部分参考基因选择需进一步优化，部分引物设计需要提高对目标转录本的区分能力，或部分实验目的与检测策略之间需要进一步匹配。相关问题均会在正式执行前完成修正。

3.4 正式报价

根据样本数量、检测基因数量、是否需要核酸提取、是否需要逆转录、是否需要引物设计与验证、是否需要图版整理及统计分析等因素，出具正式报价方案。

3.5 签订合同并支付预付款

双方确认合作内容、项目周期、交付标准及售后支持范围后，签订合同并进入项目执行阶段。

3.6 实验执行

实验执行过程包括样本登记、核酸提取、质量评估、逆转录、PCR/qPCR扩增、对照设置、数据整理及统计分析等环节。对于特殊样本或复杂项目，将根据项目特点增加必要的优化与验证步骤。

3.7 结果确认与完整交付

实验完成后，先提交PDF版结果报告供客户确认。尾款支付完成后，交付完整终版报告、原始数据、扩增曲线、熔解曲线、Ct/Cq数据表、统计图及整理后的发表或汇报素材。

四、样本要求与送样说明

4.1 常见样本类型要求

细胞沉淀样本建议保证每个样本具有充足细胞量，并尽量避免降解，通常采用液氮速冻或-80℃保存，干冰运输，适用于RNA提取与基因表达分析。

新鲜组织样本建议尽快取材并及时稳定RNA，通常采用液氮速冻或RNA保存液条件运输。组织样本中的RNA更易降解，因此前处理速度对结果质量影响较大。

RNA样本需明确浓度、纯度及保存条件，一般要求-80℃保存、干冰运输，并尽量避免反复冻融，适用于直接逆转录与RT-qPCR分析。

DNA样本需明确浓度、纯度和使用目的，通常采用低温运输，适用于常规PCR、qPCR、基因分型和拷贝数分析。

血液或PBMC样本需说明抗凝方式并尽快处理，通常采用冰上或按方案运输，适用于免疫相关转录分析。

FFPE或固定样本核酸在送样前需提前评估是否适合目标检测，其降解程度可能影响扩增效率和结果解释。

4.2 客户需同步提供的信息

为保证实验设计的准确性，客户应尽量同步提供目标基因、物种信息、分组设置、样本类型、研究方向、参考文献，以及是否需要区分剪接体或特定转录本等关键信息。这些内容有助于引物设计、内参筛选和定量方案制定。

4.3 样本质量特别说明

RNA样本应尽量避免RNase污染。不同样本类型和处理条件下，参考基因的稳定性并不一致，因此不建议固定使用GAPDH或ACTB。对于表达量特别低的靶标，需预先评估检测灵敏度与引物效率。病原体检测、分型、拷贝数分析与基因表达分析在样本前处理要求上也存在差异，应根据具体目的分别设定方案。

五、交付内容与售后支持

5.1 标准交付内容

项目交付通常包括中文版实验报告、样本信息、引物信息、实验方法说明、核酸质量说明、对照设置说明、原始Ct/Cq数据、相对定量结果表、统计分析图、图注说明、结果描述、结论总结及完整终版报告。

5.2 售后支持内容

项目完成后可持续提供售后支持，主要包括结果解释、Ct/Cq数据分析说明、图版整理、投稿补充材料支持、后续答疑及补充说明。通过后续服务，帮助客户更顺利地开展结果使用、数据汇报及科研写作工作。

六、周期与报价方式

6.1 项目周期

常规RT-qPCR项目周期通常为15至30个工作日。若项目涉及多基因panel、样本前处理、RNA提取、引物设计与验证、复杂样本基质、复测或发表级图版整理，整体周期将相应延长。相较于部分蛋白层面实验，PCR/qPCR在目标明确、样本条件清晰时，通常具有更高的标准化程度和更快的执行效率。

6.2 报价影响因素

项目报价主要受以下因素影响：样本数量、检测基因数量、是否需要核酸提取、是否需要逆转录、是否需要引物设计与验证、是否需要多重检测或panel设计、是否需要复孔与重复实验、是否需要复测补测，以及是否需要统计分析和发表级图版整理等。

附录A 实验设计与质量控制

A1 PCR原理与实验基础

PCR的核心原理是利用引物与模板之间的特异性结合，在DNA聚合酶作用下经过变性、退火和延伸循环，对目标核酸片段进行指数级扩增。qPCR在此基础上加入荧光检测体系，实现扩增过程的实时监测和定量分析。RT-qPCR则是在RNA先逆转录为cDNA后进行定量扩增，因此特别适合mRNA表达分析。

A2 标准实验步骤

实验通常包括样本处理与核酸提取、核酸质量评估、逆转录、引物或探针设计与验证、反应体系建立、对照设置、扩增与实时检测、熔解曲线或特异性验证，以及后续数据分析等步骤。每一步都直接关系到结果的可靠性，尤其对于发表用途或高要求项目，更需要进行规范的过程控制。

A3 对照设置与数据可信度

常见对照包括无模板对照、无逆转录对照、阳性对照、DNA污染控制以及参考基因或内参对照。对于采用SYBR Green体系的项目，通常还需结合熔解曲线分析，判断是否存在非特异扩增或引物二聚体。对照设置是否完整，是评估结果可信度的重要基础。

A4 内参基因选择原则

参考基因应在当前实验条件下保持稳定表达，避免机械套用单一housekeeping基因。常规细胞系项目常以GAPDH、ACTB、B2M、HPRT1、TBP等作为候选；组织样本项目可考虑GAPDH、ACTB、RPLP0、TBP、PPIA；炎症或免疫刺激模型中则需关注GAPDH或ACTB稳定性受处理因素影响的情况。对于PBMC、免疫细胞、肿瘤样本、干细胞或分化模型等特殊体系，通常建议从多个候选内参中进行筛选。若条件允许，采用两个及以上稳定参考基因进行归一化会更稳妥。

附录B PCR与其他实验方法的选择逻辑

B1 方法选择的总体原则

实验方法的选择应始终围绕研究问题展开。不同实验方法对应的检测对象、应用场景和结果类型并不相同。PCR主要解决核酸层面的问题，而其他常见实验方法分别适用于蛋白表达、蛋白定位、分泌因子定量及细胞群体分析等不同研究目的。为提高实验路线的合理性，建议先明确研究目标，再匹配相应方法。

B2 PCR/RT-qPCR：适用于核酸存在性与转录水平分析

PCR及RT-qPCR主要用于检测DNA或RNA是否存在，以及其表达水平是否发生变化。常见应用包括基因表达分析、病原体核酸检测、基因分型、SNP判定、拷贝数分析、RNA干扰验证及药物作用后的转录响应指标检测等。

当研究问题涉及目标基因是否存在、mRNA是否上调或下调、样本中是否检出特定核酸序列、某个位点是否发生分型差异，或样本拷贝数是否变化时，通常优先考虑PCR或RT-qPCR。该方法具有灵敏度高、检测速度快、适合批量样本分析且便于标准化实施等优势；其局限在于不能直接提供蛋白表达、蛋白修饰或蛋白定位信息。

B3 Western blot：适用于蛋白表达、磷酸化与切割状态分析

Western blot主要用于检测蛋白表达水平、蛋白分子量变化、蛋白磷酸化状态以及蛋白切割体等信息。对于信号通路研究而言，很多关键变化发生在蛋白活化层面，因此仅依赖qPCR往往难以形成完整结论。

当研究问题涉及蛋白是否表达、蛋白是否发生磷酸化、蛋白是否被切割、蛋白分子量是否正确，或蛋白是否处于活化状态时，通常优先选择Western blot。例如AKT、ERK、STAT3、p65、AMPK、mTOR等经典通路核心指标，通常更依赖磷酸化状态判断。Western blot能够提供蛋白层面的直接证据，但实验周期、标准化程度和通量通常低于qPCR。

B4 ELISA：适用于可溶性蛋白和分泌因子定量检测

ELISA主要用于检测上清、血清或其他体液样本中的可溶性蛋白、细胞因子、趋化因子和抗体水平变化。该方法更关注目标分子的浓度变化，不以核酸水平或蛋白分子量信息为主要输出。

当研究问题涉及某种分泌蛋白浓度是否升高、炎症因子释放水平是否变化，或抗体浓度是否发生改变时，ELISA通常更直接。PCR可用于检测相关基因的转录变化，但无法替代对分泌蛋白实际浓度的判断。ELISA具备较强的定量能力，也适合较高通量分析。

B5 免疫组化：适用于组织水平的蛋白表达定位分析

免疫组化主要用于组织切片中的目标蛋白检测，能够保留组织结构并观察蛋白在不同组织区域或病理结构中的分布情况。该方法特别适用于病理分析及组织定位相关研究。

当研究问题涉及目标蛋白在组织中的表达位置，或某种蛋白在肿瘤组织、炎症组织或器官切片中的分布情况时，免疫组化通常更匹配。PCR虽然可以提示相关基因在整体样本中的转录变化，但无法提供蛋白位于哪一类细胞、哪一层组织或哪一区域的信息。

B6 免疫荧光：适用于细胞内定位、转位与共定位分析

免疫荧光主要用于检测细胞或组织中的目标蛋白分布情况，尤其适用于亚细胞定位、蛋白转位、共定位和形态学观察。该方法可直观显示蛋白位于细胞核、细胞质、细胞膜或特定细胞器中的分布特征。

当研究问题涉及蛋白是否进入细胞核、两个蛋白是否共定位，或药物处理后蛋白是否发生转位时，免疫荧光通常更合适。PCR可以提示转录水平变化，但无法直接说明蛋白空间位置是否改变。

B7 流式细胞术：适用于细胞群体比例与功能状态分析

流式细胞术主要用于单细胞水平的多参数检测，可用于分析不同细胞群体的比例变化、表面标志物表达、细胞周期、凋亡状态以及免疫分型等问题。其核心优势在于能够从混合细胞样本中分辨不同细胞亚群。

当研究问题涉及某类免疫细胞比例是否变化、处理后细胞是否发生凋亡，或不同细胞亚群的表型是否改变时，流式细胞术通常更具解释力。PCR检测得到的往往是整体样本的平均核酸水平，难以区分具体是哪一类细胞发生变化，也无法直接提供细胞群体构成信息。

B8 不同研究问题对应的优先方法

B8.1 核酸与转录层面问题

（1）想看mRNA是否上调或下调，优先选择RT-qPCR。
（2）想看DNA是否存在、是否扩增或是否存在分型差异，优先选择PCR或qPCR。

B8.2 蛋白层面问题

（1）想看蛋白是否表达、是否发生磷酸化、切割或活化，优先选择Western blot。
（2）想看可溶性蛋白或分泌因子浓度是否变化，优先选择ELISA。
（3）想看蛋白在组织中的表达位置，优先选择免疫组化。
（4）想看蛋白在细胞内的定位、转位或共定位，优先选择免疫荧光。

B8.3 细胞群体与功能状态问题

（1）想看不同细胞群体比例、免疫表型或细胞状态是否变化，优先选择流式细胞术。

B9 实验路线选择的核心原则

实验方法之间并无绝对优劣，关键在于是否与研究问题匹配。PCR/RT-qPCR适合核酸层面的存在性与定量分析，是基因表达研究和核酸检测中的重要方法；对于蛋白表达、蛋白活化、蛋白空间定位以及细胞群体构成等问题，则建议优先采用更对应的实验技术。

对于科研项目和药效研究而言，合理的实验设计通常建立在研究目标与方法匹配的基础上，必要时可联合使用PCR、Western blot、ELISA、免疫荧光或流式细胞术，以获得更完整、更具解释力的研究结果。

附录C 常见问题

C1 PCR主要检测什么

PCR主要检测核酸。常规PCR更适合特定DNA片段扩增与定性判断，qPCR用于核酸靶标的实时检测和定量，RT-qPCR则主要用于RNA逆转录后的定量分析。

C2 PCR能否检测蛋白表达

PCR不能直接检测蛋白表达、蛋白活化、磷酸化、切割或定位。此类问题通常建议采用Western blot、免疫组化、免疫荧光或流式细胞术等更匹配的技术路线。

C3 为什么很多信号通路研究不适合只做PCR

许多信号通路的关键变化发生在蛋白活化层面。例如AKT、ERK、STAT3、p65、AMPK、mTOR等常见核心指标更依赖磷酸化状态判断，qPCR无法替代这些蛋白层面的结论。PCR更适合用于检测这些通路下游的转录响应基因。

C4 PCR、qPCR与RT-qPCR有什么区别

常规PCR主要用于扩增和定性判断，qPCR可对扩增过程进行实时监测并实现定量分析，RT-qPCR则是在RNA逆转录为cDNA后进行实时定量扩增，主要用于基因表达检测。

C5 为什么参考基因不能固定只用GAPDH

参考基因的稳定性取决于样本类型和处理条件。不同组织、不同刺激条件、不同模型体系下，GAPDH或ACTB不一定保持稳定，因此应结合实验体系筛选合适内参。

C6 结果是否可直接用于科研发表

项目交付通常包含原始数据、统计图、图注说明及整理版图表，可直接用于论文撰写、汇报展示和结题材料整理。对于有发表需求的项目，还可进一步提供图版整理和补充材料支持。

附录D 70个常见通路的PCR下游mRNA推荐清单

本附录作为推荐使用，目的在于帮助客户在方案设计阶段更快找到适合作为转录响应指标的候选mRNA。不同细胞类型、物种、刺激条件、给药时程和样本来源会显著影响通路下游基因的响应模式，因此以下内容更适合作为初筛清单和项目讨论基础。正式立项时，仍建议结合具体模型进行预实验验证。

D1 使用原则

D1.1 转录调控型通路更适合采用PCR作为转录响应指标

对于以转录调控为核心输出的通路，PCR特别适合作为转录响应指标，例如Wnt、Notch、Hedgehog、TGF-β、NF-κB、JAK/STAT、干扰素、缺氧、p53等。

D1.2 蛋白活化型通路更适合检测下游响应基因

对于以蛋白磷酸化、蛋白复合体装配或亚细胞转位为核心的通路，PCR更适合检测其下游响应基因，不宜单独作为通路活化本身的唯一证据，例如AKT、ERK、mTOR、AMPK、YAP/TAZ、NFAT、β-catenin核转位等。

D1.3 通路交叉明显时建议采用小型panel设计

对于通路交叉显著的项目，建议避免只测单个基因，更适合采用“小型panel”方式提高解释力。

D2 发育与干细胞相关通路

D2.1 Wnt/β-catenin通路
推荐下游mRNA：AXIN2、MYC、CCND1、LGR5。
适用说明：AXIN2是最常用的经典转录响应指标，适合用于判断canonical Wnt转录输出是否增强。

D2.2 非经典Wnt/PCP通路
推荐下游mRNA：JUN、FOS、PTK7、VANGL2。
适用说明：该通路更偏细胞极性与迁移调控，PCR适合结合迁移表型联合判断。

D2.3 Wnt/Ca2+通路
推荐下游mRNA：NFATC1、RCAN1、COX2、IL2。
适用说明：更适合在免疫或刺激模型中作为转录响应指标使用。

D2.4 Notch通路
推荐下游mRNA：HES1、HEY1、HEY2、NRARP。
适用说明：HES1、HEY1是最常见的一线转录响应指标，适合用于配体刺激或抑制剂干预后的验证。

D2.5 Hedgehog通路
推荐下游mRNA：GLI1、PTCH1、HHIP、BCL2。
适用说明：GLI1和PTCH1是文献中最常用的Hedgehog激活标志。

D2.6 TGF-β/SMAD通路
推荐下游mRNA：SERPINE1、CTGF、SMAD7、PMEPA1。
适用说明：适合纤维化、EMT、肿瘤微环境和组织重塑相关研究。

D2.7 BMP通路
推荐下游mRNA：ID1、ID2、ID3、SMAD6。
适用说明：BMP下游最常见的转录响应指标是ID家族基因。

D2.8 Activin通路
推荐下游mRNA：INHBA、LEFTY1、LEFTY2、SMAD7。
适用说明：适用于发育、生殖和干细胞相关模型。

D2.9 Hippo/YAP-TAZ通路
推荐下游mRNA：CTGF、CYR61、ANKRD1、AMOTL2。
适用说明：YAP/TAZ的核心转录响应指标通常以CTGF、CYR61最为常见。

D2.10 FGF通路
推荐下游mRNA：DUSP6、ETV4、ETV5、SPRY2。
适用说明：DUSP6是FGF-ERK轴常用转录响应指标。

D2.11 EGF/EGFR通路
推荐下游mRNA：EGR1、FOS、JUN、DUSP1。
适用说明：多用于短时刺激模型，适合观察早期即刻反应基因。

D2.12 PDGF通路
推荐下游mRNA：EGR1、FOS、CCND1、MMP9。
适用说明：适用于成纤维细胞、血管平滑肌和肿瘤间质相关研究。

D2.13 VEGF通路
推荐下游mRNA：KDR、DLL4、ANGPT2、ESM1。
适用说明：适用于血管生成和内皮细胞模型。

D2.14 HGF/MET通路
推荐下游mRNA：ETS1、MMP9、CXCL8、EGR1。
适用说明：适合迁移、侵袭和肿瘤细胞可塑性研究。

D2.15 IGF通路
推荐下游mRNA：CCND1、MYC、BCL2、IRS2。
适用说明：应注意该通路与PI3K/AKT和MAPK交叉明显。

D3 炎症、免疫与先天防御相关通路

D3.1 TNF/NF-κB通路
推荐下游mRNA：NFKBIA、TNFAIP3、CXCL8、IL6。
适用说明：NFKBIA、TNFAIP3适合做快速反应转录响应指标，IL6、CXCL8适合炎症输出判断。

D3.2 经典NF-κB通路
推荐下游mRNA：NFKBIA、TNFAIP3、CCL2、BIRC3。
适用说明：适合配合p65蛋白水平或核转位结果共同解释。

D3.3 非经典NF-κB通路
推荐下游mRNA：CXCL12、CCL19、BAFF、NFKB2。
适用说明：更适用于淋巴组织、生发中心和免疫发育相关研究。

D3.4 IL-1通路
推荐下游mRNA：IL6、CXCL8、PTGS2、CCL2。
适用说明：常用于炎症刺激和免疫激活模型。

D3.5 IL-6/JAK/STAT3通路
推荐下游mRNA：SOCS3、BCL3、CCL2、MYC。
适用说明：SOCS3是最常用的经典转录响应指标之一。

D3.6 IFN-α/β通路
推荐下游mRNA：ISG15、MX1、OAS1、IFIT1。
适用说明：适合抗病毒应答和先天免疫激活研究。

D3.7 IFN-γ/STAT1通路
推荐下游mRNA：IRF1、CXCL10、GBP1、IDO1。
适用说明：适合免疫活化、炎症和肿瘤免疫模型。

D3.8 STAT5通路
推荐下游mRNA：CISH、BCL2L1、SOCS2、PIM1。
适用说明：常见于造血、乳腺、内分泌和细胞因子反应模型。

D3.9 STAT6通路
推荐下游mRNA：CCL17、CCL22、ARG1、MRC1。
适用说明：适合Th2、过敏炎症及M2极化研究。

D3.10 Toll-like receptor通路
推荐下游mRNA：TNF、IL6、IL1B、CXCL10。
适用说明：可结合不同TLR激动剂进行分型式转录响应指标设计。

D3.11 cGAS-STING通路
推荐下游mRNA：IFNB1、CXCL10、ISG15、IFIT1。
适用说明：适合DNA感知和先天抗病毒、抗肿瘤免疫研究。

D3.12 RIG-I/MDA5通路
推荐下游mRNA：IFNB1、DDX58、IFIH1、OAS2。
适用说明：适合RNA病毒模拟刺激或核酸药物评价。

D3.13 NOD-like receptor通路
推荐下游mRNA：NOD2、CXCL8、TNF、IL6。
适用说明：适合细菌组分刺激和黏膜免疫研究。

D3.14 NLRP3炎症小体相关通路
推荐下游mRNA：NLRP3、IL1B、CASP1、PYCARD。
适用说明：PCR更适合观察启动阶段的转录准备过程，而成熟IL-1β释放通常建议结合蛋白检测。

D3.15 TCR通路
推荐下游mRNA：IL2、CD69、NR4A1、FOS。
适用说明：适合T细胞激活研究，通常与流式细胞术联用更佳。

D3.16 BCR通路
推荐下游mRNA：MYC、EGR1、IRF4、CD69。
适用说明：适用于B细胞激活和分化模型。

D3.17 CD40通路
推荐下游mRNA：TNFAIP3、ICAM1、IL6、CD83。
适用说明：适用于树突细胞、B细胞和免疫共刺激研究。

D3.18 补体相关通路
推荐下游mRNA：C3、CFB、C5AR1、SERPING1。
适用说明：适合炎症微环境和先天免疫补体轴研究。

D3.19 趋化因子信号通路
推荐下游mRNA：CCL2、CCL5、CXCL10、CXCL12。
适用说明：适用于免疫迁移、肿瘤微环境和炎症招募研究。

D3.20 AHR通路
推荐下游mRNA：CYP1A1、CYP1B1、AHRR、TIPARP。
适用说明：该通路下游转录响应指标较成熟，适合环境暴露、屏障组织和免疫调控研究。

D4 生长、生存与肿瘤相关通路

D4.1 RAS通路
推荐下游mRNA：DUSP6、FOS、EGR1、MYC。
适用说明：适合评估RAS-MAPK轴的转录输出。

D4.2 RAF/MEK/ERK通路
推荐下游mRNA：EGR1、FOS、JUN、DUSP6。
适用说明：更适合短时程动态检测，建议设置多个时间点。

D4.3 JNK通路
推荐下游mRNA：JUN、ATF3、FOSL1、MMP9。
适用说明：适合应激、炎症和凋亡相关研究。

D4.4 p38 MAPK通路
推荐下游mRNA：DUSP1、IL6、TNF、ATF3。
适用说明：适合炎症应激和细胞毒性反应研究。

D4.5 PI3K通路
推荐下游mRNA：MYC、CCND1、BCL2、SREBF1。
适用说明：PCR更适合作为下游转录响应指标，不能替代p-AKT等蛋白活化检测。

D4.6 AKT通路
推荐下游mRNA：CCND1、BCL2L1、HK2、GLUT1。
适用说明：适用于生存、代谢和增殖模型，建议结合蛋白磷酸化结果共同解释。

D4.7 mTORC1通路
推荐下游mRNA：SREBF1、FASN、HMGCR、LDLR。
适用说明：适合脂质代谢和蛋白合成相关研究。

D4.8 mTORC2通路
推荐下游mRNA：SGK1、RICTOR相关响应基因、FOXO靶基因抑制谱、BCL2L1。
适用说明：该通路PCR转录响应指标相对间接，建议作为辅助信息使用。

D4.9 FOXO通路
推荐下游mRNA：CDKN1B、GADD45A、BCL2L11、SOD2。
适用说明：适合氧化应激、代谢和细胞命运研究。

D4.10 MYC通路
推荐下游mRNA：ODC1、NCL、CAD、LDHA。
适用说明：适合增殖、代谢重编程和肿瘤模型。

D4.11 MYB通路
推荐下游mRNA：BCL2、KIT、MYC、CCNB1。
适用说明：适合造血和肿瘤相关模型。

D4.12 SRC/FAK通路
推荐下游mRNA：MMP2、MMP9、ITGB1、VIM。
适用说明：适合黏附、迁移和侵袭相关研究。

D4.13 Integrin通路
推荐下游mRNA：ITGA5、ITGB1、FN1、MMP9。
适用说明：适合ECM相互作用和细胞迁移项目。

D4.14 EMT相关通路
推荐下游mRNA：CDH1、VIM、SNAI1、ZEB1。
适用说明：适合肿瘤转移、纤维化和组织重塑研究。

D4.15 细胞周期通路
推荐下游mRNA：CCND1、CCNE1、CDK1、MKI67。
适用说明：适合增殖、药效评价和细胞命运研究。

D5 应激、损伤与稳态调控相关通路

D5.1 p53通路
推荐下游mRNA：CDKN1A、MDM2、BBC3、GADD45A。
适用说明：CDKN1A和MDM2是经典的一线转录响应指标。

D5.2 DNA damage response/ATM-ATR通路
推荐下游mRNA：GADD45A、CDKN1A、DDB2、XPC。
适用说明：适合DNA损伤、放疗药物和毒理研究。

D5.3 凋亡通路
推荐下游mRNA：BAX、BCL2、BBC3、NOXA。
适用说明：PCR可用于观察凋亡倾向，执行层凋亡过程通常建议结合蛋白和流式细胞术。

D5.4 氧化应激/NRF2通路
推荐下游mRNA：HMOX1、NQO1、GCLC、TXNRD1。
适用说明：NRF2靶基因的PCR转录响应指标较成熟，适合药物和毒理评价。

D5.5 缺氧/HIF-1通路
推荐下游mRNA：VEGFA、SLC2A1、CA9、BNIP3。
适用说明：适合缺氧培养、肿瘤微环境和代谢研究。

D5.6 ER stress/UPR通路
推荐下游mRNA：DDIT3、XBP1s、HSPA5、ATF4。
适用说明：适合蛋白折叠压力、代谢疾病和药物损伤研究。

D5.7 自噬通路
推荐下游mRNA：BECN1、ATG5、MAP1LC3B、SQSTM1。
适用说明：PCR适合作为转录层辅助证据，自噬流通常建议结合蛋白指标。

D5.8 热休克反应通路
推荐下游mRNA：HSPA1A、HSPH1、DNAJB1、BAG3。
适用说明：适合温度、药物和蛋白稳态应激研究。

D5.9 炎症-COX2轴
推荐下游mRNA：PTGS2、IL6、CXCL8、CCL2。
适用说明：适用于炎症放大、组织损伤和肿瘤微环境研究。

D5.10 一氧化氮相关通路
推荐下游mRNA：NOS2、ARG1、IL1B、TNF。
适用说明：常用于巨噬细胞极化与炎症模型。

D5.11 ROS-MAPK应激轴
推荐下游mRNA：ATF3、JUN、DUSP1、HMOX1。
适用说明：适合氧化损伤与化学刺激研究。

D5.12 纤维化通路
推荐下游mRNA：COL1A1、FN1、ACTA2、SERPINE1。
适用说明：多与TGF-β、YAP/TAZ、炎症轴共同解释。

D6 代谢、核受体与微环境相关通路

D6.1 AMPK通路
推荐下游mRNA：PGC1A、CPT1A、PDK4、SIRT1。
适用说明：AMPK活化本身主要看蛋白磷酸化，PCR更适合检测代谢重编程输出。

D6.2 胰岛素信号通路
推荐下游mRNA：SREBF1、FASN、G6PC、PCK1。
适用说明：需结合模型背景判断，是代谢研究中的常用转录响应指标组合。

D6.3 PPARα通路
推荐下游mRNA：CPT1A、ACOX1、FABP1、HMGCS2。
适用说明：适合脂肪酸氧化和肝脏代谢研究。

D6.4 PPARγ通路
推荐下游mRNA：FABP4、ADIPOQ、CD36、PLIN1。
适用说明：适合脂肪生成、代谢综合征和分化模型。

D6.5 LXR通路
推荐下游mRNA：ABCA1、ABCG1、SREBF1、FASN。
适用说明：适合胆固醇转运与脂代谢研究。

D6.6 FXR通路
推荐下游mRNA：SHP、BSEP、OSTA、FGF19。
适用说明：适合胆汁酸代谢和肝肠轴研究。

D6.7 雌激素受体通路
推荐下游mRNA：PGR、GREB1、TFF1、CCND1。
适用说明：适合激素依赖性肿瘤和内分泌相关研究。

D6.8 雄激素受体通路
推荐下游mRNA：KLK3、TMPRSS2、FKBP5、NKX3-1。
适用说明：适合前列腺和激素反应模型，是核受体项目中较成熟的PCR转录响应指标体系。

D7 附录使用建议

D7.1 推荐以“小型panel”方式立项

对于大多数项目，建议避免只测一个所谓“通路标志基因”。更推荐每条通路选择2至4个经典下游mRNA，组成一个小型panel，并根据研究问题加入1至2个功能输出基因。这样既能减少单基因偶然波动带来的影响，也更有利于后续论文与报告解释。

D7.2 注意刺激时间窗

某些通路的转录响应指标属于早期即刻反应基因，例如EGR1、FOS、JUN、ATF3；另一些则更适合中晚期时间窗检测，例如COL1A1、FN1、ACTA2、FABP4、ADIPOQ。项目设计时应提前结合刺激时长和取样时间安排检测节点。

D7.3 注意通路活化与转录输出的区别

对于AKT、ERK、mTOR、AMPK、YAP/TAZ、NFAT、NF-κB等通路，PCR观察到的是下游转录结果，并不等同于蛋白活化本身。若项目目标是证明信号蛋白是否磷酸化、是否核转位、是否被剪切或是否形成复合体，通常仍建议结合Western blot、免疫荧光或其他蛋白层面实验共同判断。

D7.4 注意不同模型的转录响应指标不完全通用

同一通路在不同细胞系、原代细胞、组织样本、肿瘤模型和动物模型中的敏感转录响应指标可能并不一致。附录中的推荐更适合作为首轮筛选目录，正式项目中建议根据样本背景、文献基础和预实验结果进一步缩小panel。