铁死亡、焦亡、坏死性凋亡、铜死亡这些细胞死亡方式，现在很多实验室已经非常熟悉。

但还有一种细胞死亡，在神经损伤、缺血再灌注、氧化应激、DNA损伤和部分肿瘤研究中越来越常见：

Parthanatos。

很多人第一次接触Parthanatos时，会发现它的机制有点特殊。

因为这条死亡通路的起点，居然是一个我们通常认为负责“救细胞”的DNA修复蛋白：

PARP1。

DNA发生损伤以后，PARP1会被激活，通过PARylation参与DNA损伤应答和修复。

轻度DNA损伤时，这套系统有利于细胞生存。

但如果DNA损伤过于严重，PARP1持续过度激活，大量poly(ADP-ribose)，也就是PAR不断生成，整个过程就可能从DNA修复逐渐滑向细胞死亡。

随后发生的事情也和经典凋亡很不一样。

线粒体中的AIF被释放出来并转位进入细胞核，进一步招募具有核酸酶功能的MIF进入细胞核，最终造成大尺度DNA断裂。

与此同时，PARP1持续消耗NAD+，还可能进一步造成明显的细胞能量代谢压力。

因此，Parthanatos最经典的一条机制链可以概括为：

严重DNA损伤→PARP1过度激活→PAR大量积累→线粒体AIF释放→AIF/MIF进入细胞核→大尺度DNA断裂→细胞死亡。

这条死亡过程通常并不依赖经典Caspase执行。

它也不像单纯意外性坏死那样缺少明确的分子程序。

所以Parthanatos真正值得研究的地方，就在于它建立了一条非常特殊的“细胞核—线粒体—细胞核”死亡回路。

但Parthanatos研究也特别容易做成一个只有几张Western blot的课题：

PARP1升高；

AIF升高；

细胞活率下降；

于是就写成“发生Parthanatos”。

这个证据其实远远不够。

因为PARP1表达升高和PARP1过度活化是两件事。

AIF总蛋白增加和AIF从线粒体转位到细胞核也是两件事。

TUNEL阳性、LDH升高、Annexin V/PI双阳，这些指标同样无法直接告诉我们细胞是不是发生了Parthanatos。

所以，真正想把Parthanatos做清楚，需要围绕几个关键问题逐层验证：

PARP1到底有没有被过度激活？

PAR有没有真正大量积累？

AIF有没有发生线粒体—细胞核转位？

MIF有没有进入细胞核并执行DNA切割？

死亡是否具有Caspase非依赖性？

阻断PARP1、AIF或者MIF以后，细胞能不能被真正救回来？

把这几层证据串起来，才有可能真正证明Parthanatos。

1、它属于PARP1过度激活驱动的调控性细胞死亡

Parthanatos这个名称来自PAR和希腊神话中的死亡之神Thanatos。

它的核心并不只是“DNA损伤以后细胞死了”。

真正具有辨识度的是PARP1—PAR—AIF相关死亡程序。

正常情况下，PARP1位于细胞核中，可以识别DNA损伤，并利用NAD+作为底物合成PAR链，对自身以及其他相关蛋白进行PARylation，从而参与DNA损伤应答。

当损伤处于可修复范围时，这套系统能够帮助细胞恢复。

当DNA损伤非常严重、PARP1长时间过度激活以后，PAR大量积累，细胞开始进入完全不同的状态。

这时PARP1已经从DNA损伤应答中的保护节点，逐渐变成死亡信号的启动节点。

2、Parthanatos具有明显的细胞核—线粒体串扰

这一点是它非常有意思的地方。

整个过程最初发生在细胞核。

DNA损伤激活PARP1。

随后PAR相关死亡信号从细胞核传向线粒体。

线粒体AIF释放。

AIF再从线粒体进入细胞核。

最终DNA又在细胞核中发生大尺度破坏。

整个过程形成了：

细胞核→线粒体→细胞核

这样一个非常典型的死亡信号回路。

这与很多经典死亡方式主要依赖Caspase、Gasdermin、MLKL或者脂质过氧化执行，有明显差异。

3、它通常具有Caspase非依赖性特点

经典凋亡最重要的执行系统之一是Caspase级联。

例如Caspase-9、Caspase-3/7活化以后，会切割大量细胞内底物，并最终形成典型凋亡表型。

Parthanatos的经典执行过程通常不依赖Caspase。

因此，即使使用广谱Caspase抑制剂，有时仍然无法有效阻止这种死亡。

这也是Parthanatos和经典apoptosis进行鉴别时非常重要的一条功能证据。

4、Parthanatos最终也可能出现膜完整性丧失

随着死亡过程继续发展，细胞最终仍然可能发生细胞膜破坏和胞内内容物释放。

所以单纯依靠LDH、PI或者Annexin V/PI很难识别Parthanatos。

这些方法能够告诉我们：

细胞死了；

膜坏了。

但它们不能回答：

是谁把细胞杀死的。

1、PARP1首先是DNA损伤感受器和修复调节分子

DNA发生单链或者双链损伤以后，PARP1可以快速参与损伤识别。

随后利用NAD+合成PAR链。

PARylation能够改变蛋白功能、蛋白相互作用和染色质环境，同时帮助募集相关DNA修复蛋白。

所以PARP1本身并不能简单定义为“促死亡蛋白”。

真正需要区分的是：

正常激活；

和过度激活。

2、轻度损伤和严重损伤可能把PARP1推向两个完全不同的结果

如果DNA损伤较轻，PARP1短时间激活以后，DNA完成修复，PAR又被PARG等系统降解，细胞可以恢复稳态。

如果细胞经历持续、严重的氧化应激、硝化应激、兴奋性毒性或者其他强DNA损伤，PARP1可能持续处于高活性状态。

此时PAR的产生速度和总量会大幅增加。

这就为后面的Parthanatos提供了条件。

3、PARP1表达升高不能直接证明PARP1过度激活

这是Parthanatos实验非常常见的问题。

很多研究做一张Western blot：

PARP1蛋白升高。

然后直接写：

“Parthanatos被激活。”

这个证据非常有限。

PARP1蛋白多，并不等于PARP1酶活一定高。

一个细胞PARP1表达量不变，也完全可能因为严重DNA损伤而发生强烈PARP1活化。

所以真正更接近Parthanatos核心状态的指标，应该继续往PARylation和PAR积累层面走。

4、PARP1切割和PARP1过度活化还要特别区分

这一点很容易和凋亡混淆。

经典凋亡过程中，PARP1本身可以被Caspase-3/7切割。

这种cleaved PARP常常作为apoptosis指标使用。

Parthanatos关注的则是具有酶活的PARP1持续过度工作并产生大量PAR。

所以：

cleaved PARP增加

和

PARP1 hyperactivation

代表的生物学意义并不相同。

如果课题同时看到Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP非常明显，就需要考虑细胞中是否同时存在经典凋亡。

1、PAR是这条死亡通路中非常重要的信号分子

PARP1过度激活以后，会持续产生poly(ADP-ribose)。

因此Parthanatos中更值得直接检测的是：

PAR有没有明显积累。

可以通过Western blot或者免疫荧光观察PAR相关信号变化。

如果实验只能做一个PARP相关指标，单纯做PARP1总蛋白的信息量通常没有直接观察PAR积累高。

2、PAR在Parthanatos中具有“death signal”的意义

大量PAR形成以后，它已经不再只是DNA修复过程中的一个瞬时修饰。

PAR能够从细胞核相关区域进入胞质，并进一步影响线粒体AIF。

经典机制研究已经证明，PAR与AIF之间存在直接功能联系。

这种PAR—AIF作用，是细胞核中的DNA损伤信号传递到线粒体的重要环节。

3、所以PARP1和PAR最好同时检测

如果实验结果是：

PARP1升高；

PAR不变；

AIF也没有核转位；

那么直接定义Parthanatos就比较勉强。

更理想的结果是：

DNA损伤增强；

PARP1过度活化；

PAR明显积累；

随后出现AIF核转位。

这样才开始形成连续的上下游关系。

4、PARG和ARH3等PAR代谢系统也可能改变最终PAR水平

细胞中的PAR并不会永久存在。

PAR还存在相应的降解系统。

所以最终PAR积累程度，实际上取决于生成和降解之间的动态平衡。

这意味着有些课题未来还可以继续追问：

疾病组PAR变高，究竟是PARP1产生得更多，还是PAR清除变慢？

这会比单纯继续寻找一个PARP1上游蛋白更有机制深度。

1、PARP1大量合成PAR需要不断消耗NAD+

PARP1进行PARylation时需要使用NAD+作为底物。

如果PARP1持续过度激活，NAD+可以出现明显消耗。

因此，Parthanatos常常伴随明显的代谢和能量压力。

2、NAD+下降还可能进一步影响ATP状态

细胞为了重新维持NAD+稳态，需要消耗代谢资源。

与此同时，严重DNA损伤、线粒体功能异常和其他代谢紊乱也可能共同造成ATP下降。

因此很多Parthanatos研究中可以看到：

NAD+下降；

ATP下降；

线粒体膜电位异常。

3、但“ATP下降”不能单独证明Parthanatos

这一点非常重要。

几乎所有严重细胞损伤最终都可能出现ATP下降。

铁死亡、严重氧化应激、线粒体毒性和普通坏死同样可以导致能量枯竭。

所以ATP应该作为：

支持性证据。

更核心的Parthanatos证据仍然是：

PARP1/PAR；

AIF核转位；

MIF相关DNA降解；

以及功能性挽救。

4、NAD+补充实验可以提供额外机制信息

如果研究重点确实怀疑能量崩溃参与细胞死亡，可以进一步检测NAD+。

必要时还可以研究恢复NAD+稳态以后，细胞死亡和AIF转位是否发生改变。

但这类实验更适合作为机制延伸。

不能用“补NAD+救活了细胞”这一条证据单独定义Parthanatos。

1、AIF正常情况下主要定位在线粒体

AIF全称是apoptosis-inducing factor。

名字里虽然带有apoptosis，但它参与的Parthanatos属于Caspase非依赖性死亡程序。

AIF正常主要位于线粒体。

因此在未受刺激的细胞中，AIF不应该大量积累于细胞核。

2、Parthanatos过程中真正关键的是AIF的位置变化

所以检测AIF时，最容易犯的错误就是只做：

Total AIF Western blot。

AIF总量完全可能没有明显变化。

但它已经从线粒体跑进了细胞核。

因此Parthanatos研究中，AIF subcellular localization通常比总蛋白表达更重要。

3、AIF核转位可以通过两类方法验证

第一类是免疫荧光。

通过AIF与DAPI等核染色进行共定位，观察处理以后AIF是否明显进入细胞核。

第二类是核浆分离。

分别检测cytoplasmic/mitochondrial-associated fraction和nuclear fraction中的AIF。

如果处理组核内AIF明显增加，就能够提供比较直接的生化证据。

条件允许时，两种方法最好相互验证。

4、AIF转位具有明显的时间顺序价值

如果研究需要证明因果链，可以做时间梯度。

例如：

先出现DNA损伤；

随后PAR增加；

再出现线粒体膜电位变化；

随后AIF进入细胞核；

最后才出现大量DNA断裂和细胞死亡。

时间顺序能够帮助判断：

哪些是上游事件；

哪些更接近死亡执行。

这比所有指标只做一个24小时终点更有说服力。

1、这是Parthanatos机制里一个非常关键的问题

早期研究已经知道：

PARP1过度激活以后，AIF会从线粒体释放并进入细胞核。

同时细胞会发生染色质改变和大尺度DNA断裂。

但后来出现了一个很关键的问题：

AIF本身并不是一个典型DNA核酸酶。

那么AIF进入细胞核以后，到底是谁在真正执行DNA切割？

2、答案逐渐指向了MIF

MIF全称macrophage migration inhibitory factor。

很多科研人员最熟悉的MIF身份，是一个与炎症和免疫调控有关的分子。

但机制研究发现，MIF还具有核酸酶活性。

更重要的是：

AIF可以与MIF形成相互作用，并帮助MIF进入细胞核。

3、所以AIF更像一个关键的死亡信号和运输节点

在经典Parthanatos机制中，可以把这个过程简单理解成：

AIF从线粒体释放；

AIF结合MIF；

AIF帮助MIF向细胞核转位；

MIF在细胞核中执行DNA切割。

这样就解决了一个很重要的机制问题：

AIF为什么进入细胞核以后会造成严重DNA破坏。

4、这也让Parthanatos从PARP1/AIF路线进一步升级成PARP1/PAR/AIF/MIF路线

如果一个研究只做到：

PARP1↑；

AIF↑；

细胞死了；

已经很难算特别完整。

更深入的研究可以继续验证：

MIF是否进入细胞核；

AIF和MIF是否发生相互作用；

干扰MIF以后DNA断裂是否减少；

干扰MIF核酸酶功能以后细胞能否被挽救。

这样才能真正进入Parthanatos的执行层。

1、MIF提供了真正的DNA切割执行机制

MIF被鉴定为PARP1依赖、AIF相关的核酸酶以后，Parthanatos后半段的机制变得清楚很多。

上游是：

DNA损伤→PARP1→PAR。

中间是：

PAR→AIF释放。

下游则进一步变成：

AIF→MIF核转位→DNA大尺度断裂。

2、MIF总蛋白同样不是最关键的信息

和AIF一样。

如果MIF总蛋白没有明显升高，也不能说明它没有参与Parthanatos。

更加重要的是：

MIF的位置有没有变化；

有没有进入细胞核；

它的核酸酶功能有没有参与DNA切割。

3、可以做AIF/MIF共定位或者Co-IP

如果研究需要把机制做深，可以进一步观察AIF和MIF之间的相互作用。

例如Co-IP证明处理以后AIF/MIF interaction增强。

或者通过免疫荧光观察两者是否共同向细胞核转位。

4、MIF knockdown可以帮助建立功能证据

如果敲低MIF以后：

AIF仍然可能发生相关变化；

但DNA大尺度损伤明显减少；

细胞死亡下降；

就能够说明MIF位于死亡执行阶段。

5、进一步可以做MIF核酸酶功能挽救

如果研究已经明确聚焦Parthanatos，可以进一步采用MIF缺失背景。

分别回补：

WT-MIF；

和核酸酶活性缺失型MIF。

如果WT能够恢复DNA断裂和细胞死亡，而核酸酶缺失型不能恢复，这类实验对于证明：

“MIF nuclease activity参与Parthanatos”

会非常有说服力。

1、和经典凋亡最大的区别之一是Caspase依赖性不同

经典凋亡通常具有明显Caspase激活。

例如Cleaved-Caspase-3明显增加。

Parthanatos的经典执行过程则主要依赖PARP1/PAR/AIF/MIF轴。

所以实验中如果广谱Caspase inhibition无法明显救援，但PARP1 inhibition能够救援，就开始具备Parthanatos方向的功能信息。

2、两种死亡的DNA断裂模式也存在差异

经典凋亡中可以出现规则的核小体间DNA切割。

Parthanatos更典型的是大尺度DNA碎裂和染色质溶解。

因此，单纯做TUNEL不能区分两者。

TUNEL只能告诉我们：

DNA断裂增加。

它并不能告诉我们DNA是通过哪种死亡方式断掉的。

3、Parthanatos中的PARP1状态也和凋亡不同

经典凋亡中PARP1可以被Caspase切割。

Parthanatos则依赖PARP1持续高活性并大量生成PAR。

所以如果研究同时出现明显Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase-3，需要考虑凋亡是否参与。

4、和坏死性凋亡相比，执行蛋白完全不同

Necroptosis主要围绕RIPK1/RIPK3/MLKL轴。

最终MLKL寡聚并作用于细胞膜。

Parthanatos则围绕DNA损伤、PARP1/PAR和AIF/MIF。

两种死亡最终都可能出现膜完整性破坏，因此：

PI阳性；

LDH升高；

细胞肿胀或膜损伤

并不足以区分它们。

如果实验背景中necroptosis也有可能发生，就需要进一步检测RIPK3、p-MLKL并进行相应功能性阻断。

5、不同死亡方式还可能同时存在

现实中的细胞死亡通常没有教科书里那么干净。

同一种强刺激可能同时激活：

apoptosis；

necroptosis；

parthanatos；

或者其他死亡程序。

一种死亡被药物抑制以后，细胞甚至可能切换到另一种死亡。

所以科研中真正重要的目标，不一定是强行把全部细胞归类成一种死亡。

更值得回答的是：

当前疾病表型中，Parthanatos贡献了多少？

阻断它以后，整体细胞死亡能恢复多少？

1、不能只依靠AIF核转位下结论

AIF核转位是Parthanatos非常重要的特征。

但AIF还可以参与其他Caspase非依赖性细胞死亡过程。

所以：

AIF进入细胞核

属于强支持证据。

它还需要结合PARP1/PAR上游和MIF/DNA断裂下游共同判断。

2、理想证据应该具有明显上下游顺序

例如：

DNA损伤↑；

PAR大量积累；

AIF核转位↑；

MIF核转位↑；

大尺度DNA断裂↑；

细胞死亡↑。

同时：

PARP1 inhibition能够同时压低后面的多个事件。

这时整条机制链才真正具有方向性。

3、还需要功能性挽救

如果AIF knockdown以后：

MIF核转位下降；

DNA断裂减轻；

细胞存活恢复；

就能够说明AIF并不只是“跟着死亡一起发生变化”。

它真正参与了死亡程序。

4、MIF干预可以进一步把上下游关系做得更清楚

例如：

敲低MIF以后，AIF依然可以发生核转位，但DNA损伤和细胞死亡明显下降。

这种结果就能把AIF和MIF的位置关系拆出来。

最终可能形成：

PARP1/PAR→AIF→MIF→DNA degradation

这样一条非常清楚的机制链。

真正想证明Parthanatos，建议至少形成四层证据。

1、第一层：证明细胞确实发生死亡

可以使用：

CCK-8或其他活力检测；

PI；

LDH；

细胞形态；

必要的Annexin V/PI。

这一步只负责证明：

刺激确实造成了细胞死亡。

不要在这一层直接定义死亡方式。

2、第二层：证明存在明显DNA损伤和PARP1/PAR激活

可以检测：

γH2AX；

Comet assay；

PAR accumulation；

PARylation；

PARP1相关状态；

NAD+；

必要时ATP。

其中PAR积累的信息尤其重要。

如果只有PARP1蛋白增加，没有PAR明显变化，Parthanatos证据比较弱。

3、第三层：证明AIF/MIF执行轴发生变化

建议重点观察：

AIF nuclear translocation；

MIF nuclear translocation；

AIF/MIF interaction；

DNA fragmentation。

AIF和MIF最好采用：

免疫荧光＋核浆分离

进行交叉验证。

4、第四层：做功能性挽救

这一层往往决定文章最后能做到多深。

可以依次干预：

PARP1；

AIF；

MIF。

如果阻断PARP1能够：

降低PAR；

减少AIF核转位；

减轻DNA损伤；

恢复细胞存活；

说明PARP1位于上游。

如果干扰AIF以后：

MIF核转位减少；

DNA断裂减少；

细胞被救回来；

说明AIF是重要中间节点。

如果敲低MIF以后：

PAR和AIF相关上游仍然存在；

但DNA断裂和死亡下降；

就能进一步把MIF定位到死亡执行阶段。

5、还需要排除最主要的替代性死亡方式

根据具体研究模型，可以针对最可能出现的其他死亡方式进行排查。

如果Cleaved-Caspase-3很高，而且Caspase inhibitor能够明显救援，需要考虑apoptosis。

如果p-MLKL明显增加并且necroptosis inhibitor能够救援，需要考虑necroptosis。

如果脂质ROS、GPX4和Ferrostatin-1相关结果明显，则要考虑ferroptosis。

这里没有必要为了证明Parthanatos，把所有已知死亡方式全部检测一遍。

重点是根据当前刺激和细胞类型，排除最有可能混入的几种死亡。

1、氧化应激模型是比较常见的入口

严重ROS可以造成DNA损伤。

因此H2O2等氧化应激条件经常被用于Parthanatos机制研究。

但浓度非常重要。

如果刺激太弱，细胞主要进入DNA修复。

如果刺激太强，可能造成大量非特异性膜损伤和普通坏死。

所以建议先建立剂量—时间曲线。

2、MNNG等DNA损伤刺激更适合直接研究PARP1依赖过程

MNNG能够造成明显DNA损伤并强烈激活PARP1，因此常被用于经典Parthanatos机制验证。

如果课题主要目的是建立：

PARP1/PAR/AIF/MIF

这条机制链，DNA损伤型刺激具有很好的实验价值。

3、神经系统研究常见兴奋性毒性和缺血相关模型

Parthanatos最经典的研究背景之一就是神经元损伤。

例如NMDA excitotoxicity、OGD/R以及脑缺血相关模型。

这些模型中氧化/硝化应激、DNA损伤和PARP1过度激活可以形成比较完整的病理链。

所以脑卒中、脊髓损伤、神经退行性疾病等方向非常适合继续研究Parthanatos。

4、肿瘤研究的逻辑可能完全相反

神经和缺血损伤研究通常希望：

抑制Parthanatos，保护细胞。

肿瘤研究有时反而希望：

诱导Parthanatos，把肿瘤细胞杀掉。

因此同一条死亡通路，在不同疾病中的研究目标可能完全相反。

这也是细胞死亡研究很值得注意的一点。

真正重要的是疾病背景和靶细胞是谁。

5、最好同时保留一个经典阳性体系

如果第一次在某种新的疾病模型中研究Parthanatos，可以同时使用一个已知能够诱导PARP1依赖性死亡的阳性条件。

这样能够确认：

抗体；

PAR检测；

AIF核转位；

核浆分离

这些技术体系本身工作正常。

否则疾病刺激阴性时，很难判断究竟是机制不存在，还是检测体系没建立好。

1、PARP1蛋白升高就定义Parthanatos

PARP1表达和PARP1过度活化需要区分。

2、只检测PARP1，不检测PAR

缺少这条死亡通路非常关键的death signal。

3、只看Cleaved-PARP

Cleaved-PARP更加常见于Caspase相关凋亡背景。

4、Total AIF升高就说AIF激活

Parthanatos更关键的是AIF从线粒体向细胞核转位。

5、只做AIF Western blot，不做亚细胞定位

大量信息会被丢失。

6、AIF进入细胞核就直接定义Parthanatos

缺少PARP1/PAR上游和MIF/DNA降解下游。

7、MIF总蛋白升高就认为MIF执行Parthanatos

更应该关注MIF核转位和核酸酶功能。

8、TUNEL阳性就判断Parthanatos

Apoptosis等多种死亡方式同样可以TUNEL阳性。

9、Comet assay阳性就直接定义Parthanatos

Comet只能证明DNA损伤或断裂。

10、LDH升高就定义Parthanatos

LDH只能说明细胞膜完整性下降。

11、Annexin V+/PI+就认为是Parthanatos

流式四象限不能直接定义具体调控性死亡方式。

12、NAD+和ATP下降就定义Parthanatos

严重细胞损伤中都可能发生能量下降。

13、只用一个PARP抑制剂就完成整个机制证明

PARP抑制同时会改变DNA修复过程。

最好增加遗传干预进行交叉验证。

14、使用PARP inhibitor救活细胞以后，就不继续做AIF和MIF

只能证明PARP相关，无法证明完整Parthanatos执行链。

15、只做一个24小时终点

无法确定DNA损伤、PAR积累、AIF转位和DNA断裂到底谁先发生。

16、刺激过强

所有细胞迅速坏死，Parthanatos特异性机制窗口被掩盖。

17、刺激过弱

只有DNA损伤和修复，没有真正进入死亡程序。

18、没有排除经典凋亡

强DNA损伤同样可以激活apoptosis。

19、看到Caspase和Parthanatos指标同时变化，就强行只解释一种死亡

真实情况下完全可能存在死亡方式共存和切换。

20、在动物组织里只做PARP1 IHC

组织层面尤其需要增加PAR、AIF/MIF亚细胞定位以及细胞类型共定位，才能判断究竟是哪类细胞发生Parthanatos。

如果现在准备围绕Parthanatos设计一个基础科研课题，可以按照下面这条路线逐层推进。

第一步，先建立疾病中的细胞死亡现象。

在目标细胞或者动物组织中确认：

细胞死亡增加；

DNA损伤增加。

这一阶段先回答疾病是否存在明显的DNA damage—cell death关系。

第二步，确认PARP1/PAR轴。

重点检测PAR积累。

再根据项目需要补充PARP1状态、PARylation、NAD+等指标。

如果PAR明显升高，而且这种变化发生在大量细胞死亡之前，就开始支持PARP1相关死亡机制。

第三步，确认线粒体—细胞核转位。

通过免疫荧光和核浆分离检测AIF。

观察AIF是否从线粒体相关区域向细胞核迁移。

第四步，进入MIF执行层。

检测MIF nuclear translocation。

必要时进一步做AIF/MIF interaction。

同时通过Comet assay、TUNEL以及更适合大尺度DNA断裂的实验评价DNA损伤。

第五步，做PARP1挽救。

采用药理抑制或者遗传干预降低PARP1功能。

观察：

PAR；

AIF转位；

MIF转位；

DNA损伤；

细胞死亡

能不能同步下降。

第六步，做AIF挽救。

降低AIF以后继续观察MIF和DNA断裂。

如果上游PAR仍然存在，但下游MIF核转位和死亡下降，就能够建立AIF的中间节点地位。

第七步，做MIF挽救。

敲低MIF以后，继续观察大尺度DNA损伤和细胞死亡。

如果AIF仍然入核，但DNA断裂明显受到抑制，就可以把MIF放到更靠近执行端的位置。

第八步，进一步做MIF核酸酶功能验证。

有条件时可以采用WT和nuclease-deficient MIF进行回补。

形成：

MIF knockdown→细胞被救活；

回补WT-MIF→死亡恢复；

回补nuclease-deficient MIF→无法完全恢复。

这一层会显著增强因果关系。

第九步，排除或者拆分其他死亡方式。

根据实验结果重点评价apoptosis、necroptosis或者其他最可能共存的死亡程序。

通过相应抑制和遗传干预判断：

Parthanatos到底是主要死亡方式；

还是多种死亡程序中的一部分。

第十步，回到动物模型。

在细胞中已经建立：

DNA damage→PARP1/PAR→AIF→MIF→DNA fragmentation→death

以后，再回到疾病动物模型。

对关键节点进行体内干预。

同时评价：

组织损伤；

器官功能；

PAR；

AIF/MIF定位；

以及疾病表型。

这样整个课题就能够从一个新的死亡表型，逐渐形成真正的机制闭环。

Parthanatos研究最大的难点，是很多常规细胞死亡指标都缺乏特异性。

CCK-8下降、LDH升高、TUNEL阳性、Annexin V/PI变化都可以证明细胞受损，但很难单独证明PARP1/PAR/AIF/MIF驱动的死亡程序。

所以方案设计阶段需要把“细胞真的死了”和“为什么死”分成两层。

博恩生物可以根据具体疾病方向和现有实验基础，协助设计Parthanatos相关细胞和动物机制研究。

在细胞模型方面，可以围绕氧化应激、DNA损伤、缺氧复氧及具体疾病相关刺激建立细胞损伤体系，并通过浓度和时间梯度确定合适的Parthanatos观察窗口，避免刺激太弱只形成DNA修复，或者刺激过强直接造成大量非特异性死亡。

在基础细胞死亡评价方面，可以开展细胞活力、LDH、Annexin V/PI、PI、TUNEL、Comet assay等实验，首先明确死亡和DNA损伤表型。

在Parthanatos机制评价方面，可以围绕PARP1、PAR accumulation、PARylation、NAD+、线粒体膜电位、AIF和MIF进行检测。

对于AIF和MIF，研究重点可以进一步放到亚细胞定位，通过免疫荧光和核浆分离判断AIF/MIF是否发生核转位，而不只停留在总蛋白表达。

对于需要进一步做深机制的项目，可以设计PARP1、AIF和MIF相关药理或遗传干预，通过siRNA、shRNA及其他方式进行功能验证，并进一步结合AIF/MIF相互作用和MIF核酸酶功能完成上下游排序。

在挽救实验方面，可以围绕“上游阻断—下游变化—细胞存活恢复”的逻辑建立机制链。

例如：

抑制PARP1以后，PAR是否下降；

AIF核转位是否下降；

MIF核转位是否下降；

DNA损伤是否恢复；

最终细胞是否被救回来。

随后继续分别干预AIF和MIF，就可以逐渐把整条通路定位清楚。

如果项目同时存在凋亡、坏死性凋亡、铁死亡等相关指标，还可以通过多种死亡方式的功能性抑制和挽救，判断当前疾病中Parthanatos究竟占据什么位置，避免仅根据几张Western blot强行定义死亡方式。

对于需要体内验证的项目，可以根据具体研究方向进一步结合脑缺血、脊髓损伤、缺血再灌注、神经退行性疾病、炎症损伤或肿瘤等相关动物模型，从组织损伤、器官功能和Parthanatos通路三个层面建立验证。

对于已经有初步结果的课题，比如目前已经看到：

PARP1升高；

AIF升高；

细胞死亡增加；

也不建议继续机械增加更多Parthanatos相关蛋白。

更值得先判断目前真正缺的是哪一层证据。

如果没有PAR，就先证明PARP1是否真的过度活化。

如果只有Total AIF，就先做AIF核转位。

如果已经做到AIF核转位，就继续研究MIF和DNA降解。

如果这些表型都有了，就进入PARP1、AIF和MIF的分层挽救。

如果抑制Parthanatos以后仍然存在大量细胞死亡，再去研究其他死亡方式有没有补偿性接管。

Parthanatos真正有意思的地方，也正在这里。

一个原本负责帮助细胞修复DNA的PARP1，在持续严重DNA损伤下，可以逐渐变成死亡信号的起点。

大量PAR把信号从细胞核传向线粒体，AIF再把死亡程序带回细胞核，最终由MIF相关核酸酶作用完成大尺度DNA破坏。

所以，研究Parthanatos真正应该抓住的并不是某一个蛋白有没有升高。

更重要的是证明这条“细胞核—线粒体—细胞核”的死亡回路到底有没有真正跑起来。

只有把PARP1过度激活、PAR积累、AIF/MIF核转位、大尺度DNA断裂和功能性挽救逐层连起来，才能真正证明：

这里发生的，是Parthanatos。