蛋白翻译后修饰，也就是post-translational modification，已经成为基础科研中非常常见的一条机制路线。

磷酸化、泛素化、乙酰化、甲基化、SUMO化、O-GlcNAc糖基化、乳酸化、琥珀酰化、棕榈酰化……

现在随便选择一个疾病、一个关键蛋白，往往都能找到某种PTM变化。

于是很多课题最后会形成一条很熟悉的机制：

疾病刺激→某修饰酶变化→目标蛋白某种修饰升高或降低→目标蛋白功能改变→疾病表型变化。

这套逻辑没有问题。

但如果只是发现“蛋白A发生了乙酰化”“蛋白B发生了乳酸化”“蛋白C泛素化下降”，现在已经越来越难形成特别有辨识度的机制。

真正值得继续往下挖的一层，是研究不同翻译后修饰之间有没有发生“串扰”。

因为一个蛋白在细胞里通常不会只接受一种修饰。

同一个蛋白可以先被磷酸化，再被E3泛素连接酶识别并降解；一个赖氨酸位点可以在乙酰化和泛素化之间竞争；一个Ser/Thr位点可能同时具有O-GlcNAc糖基化和磷酸化潜力；SUMO化以后又可能招募SUMO-targeted ubiquitin ligase，进一步触发泛素化；棕榈酰化改变蛋白膜定位以后，又可能间接决定它能不能遇到某个激酶或者E3连接酶。

这时研究问题就从：

“这个蛋白有没有某种修饰？”

推进到了：

“为什么这个修饰发生以后，另一个修饰也变了？”

“两个修饰是在竞争同一个位点，还是一个修饰为另一个修饰创造了识别条件？”

“真正决定蛋白功能的是哪一种修饰，还是两种修饰之间的顺序？”

这种PTM crosstalk，往往比单独继续寻找一个新的修饰酶，更容易形成机制上的创新。

但这个方向也特别容易做错。

最典型的情况是：

处理以后蛋白A磷酸化升高，同时泛素化也升高；

于是直接写成“磷酸化促进泛素化”。

这最多只能证明两种修饰同时发生变化。

真正要证明两种PTM之间存在因果关系，需要继续回答：

阻断第一种修饰以后，第二种修饰还会不会发生？

改变第二种修饰以后，第一种修饰是否受到影响？

两个修饰发生在同一个位点、邻近位点，还是完全不同区域？

位点突变以后，蛋白稳定性、定位、互作或者酶活到底发生了什么？

最终的细胞功能能不能通过WT和Mutant回补重新建立？

把这些证据逐层补齐以后，PTM研究才能从“发现一种修饰变化”，真正推进到“解释蛋白功能为什么发生改变”。

1、现在“某蛋白发生某种修饰”本身的信息量已经下降

早期如果发现一个重要蛋白存在一种新的翻译后修饰，本身就可能具有很高价值。

现在大量经典信号蛋白、转录因子、代谢酶和膜蛋白已经被报道存在多种PTM。

如果一个课题最后只证明：

疾病组蛋白A乙酰化升高；

抑制乙酰转移酶以后表型改善；

那么文章仍然可以成立，但后面的机制空间往往比较有限。

真正能够继续增加层次的地方，是去解释：

为什么乙酰化变化以后，这个蛋白的稳定性、定位、互作或者活性会改变？

这里经常会自然碰到第二种PTM。

2、蛋白功能本身就是多层调控的结果

一个蛋白最终发挥什么作用，至少受到蛋白量、亚细胞定位、构象、酶活性、结合伙伴和降解速度影响。

不同PTM恰好可以分别控制这些过程。

例如磷酸化可以改变构象或者产生新的蛋白识别位点，泛素化可以改变蛋白降解或者信号复合体组装，棕榈酰化可以改变膜定位，乙酰化和乳酸化可以改变电荷、蛋白互作和稳定性。

所以从生物学上看，一个蛋白同时受到多种PTM控制其实更加符合真实状态。

3、最有价值的切口往往来自“结果不一致”

假设一个蛋白mRNA没有变化，总蛋白却明显下降。

第一反应通常会去研究泛素化和蛋白酶体降解。

但继续做以后发现：

E3连接酶表达根本没变。

这时真正值得追的是：

目标蛋白是不是先发生了某一种PTM，使它突然变得容易被E3识别？

再比如，一个膜受体总蛋白完全没有变化，信号却明显下降。

这时可能不应该继续研究表达量，而应该看它有没有因为棕榈酰化、磷酸化或者糖基化变化而离开细胞膜。

这种“表达解释不了功能”的地方，往往就是PTM研究最好的入口。

4、PTM串扰比单条修饰更容易形成机制闭环

一个相对完整的故事可以是：

疾病刺激激活Kinase A；

Kinase A促进Protein B某位点磷酸化；

磷酸化以后形成E3 ligase可以识别的结构；

E3促进Protein B泛素化；

Protein B蛋白酶体降解；

下游通路发生改变；

最终导致细胞功能和疾病表型变化。

这时每一个实验都能够回答一个明确的上下游问题。

机制的解释力会明显强于：

Kinase A升高→Protein B下降→疾病加重。

PTM串扰并不只有“两个修饰抢同一个位点”。

实际研究中至少可以从几种常见模式理解。

1、同位点竞争

这是最直观的一种。

一个赖氨酸残基被乙酰化以后，同一个赖氨酸在同一蛋白分子上就无法同时承担另一种需要占据该氨基基团的修饰。

因此乙酰化、泛素化、SUMO化、乳酸化等赖氨酸修饰，在特定情况下可能形成直接竞争。

Ser/Thr上的磷酸化和O-GlcNAc糖基化也可能出现类似问题。

如果两种修饰真正作用于完全相同的残基，就存在非常直接的位点占用关系。

2、邻近位点影响

两种修饰也可能根本没有发生在同一个位点。

例如S100发生磷酸化以后，改变附近K105的空间暴露程度，使某个乙酰转移酶或者E3更容易靠近。

这种机制最终表现出来仍然是：

磷酸化变化→另一种PTM变化。

但本质属于构象或识别改变，而非位点直接竞争。

3、第一种PTM为第二种PTM创造识别标签

这是磷酸化—泛素化研究中特别经典的一类机制。

某些E3泛素连接酶并不会简单识别目标蛋白本身。

它们识别的是经过磷酸化以后形成的phosphodegron。

目标蛋白先被特定激酶磷酸化，随后E3才能有效结合，再进行泛素化和降解。

这是一种非常典型的：

PTM A→产生识别条件→PTM B

的连续机制。

4、第一种PTM招募另一套修饰系统

SUMO化—泛素化就是一个非常好的例子。

蛋白发生poly-SUMOylation以后，可以被具有SUMO-interacting motif的SUMO-targeted ubiquitin ligase识别。

随后目标蛋白继续发生泛素化，并进入后续处理或者蛋白降解。

这时SUMO化并没有和泛素化竞争。

它反而成为后续泛素化的“前置标签”。

5、第一种PTM改变蛋白所在位置

还有一些串扰发生得更加间接。

例如一个胞质蛋白发生棕榈酰化以后进入细胞膜。

只有进入细胞膜以后，它才能接触膜附近的激酶。

于是出现：

棕榈酰化→膜定位→磷酸化→信号激活。

如果棕榈酰化缺失，后面的磷酸化也会下降。

这种研究如果只检测两种PTM，很容易误以为两种修饰直接发生化学竞争。

实际上真正的中间变量是亚细胞定位。

6、一种PTM改变另一种修饰酶的功能

PTM串扰还可以发生在“酶”这一层。

例如某个去泛素化酶本身先发生棕榈酰化，稳定性因此改变。

去泛素化酶的变化再影响它的底物泛素化。

最终形成：

PTM A作用于修饰酶→修饰酶活性或稳定性变化→目标蛋白PTM B变化。

这类机制比简单的“同一个蛋白两种修饰”又多了一层调控。

1、很多蛋白的降解本来就需要先发生磷酸化

磷酸化能够快速响应细胞外刺激。

泛素化则可以进一步控制蛋白稳定性。

两者结合以后，非常适合构建快速信号调控。

例如经典的β-TrCP类E3底物识别，就常常依赖目标蛋白上的特定磷酸化degron。

因此当实验中看到：

某蛋白磷酸化升高；

随后总蛋白下降；

MG132能够把蛋白救回来；

这时非常值得考虑磷酸化依赖性泛素降解。

2、第一步需要证明磷酸化发生在蛋白下降之前

时间序列非常重要。

例如刺激以后：

15 min，p-Protein开始升高；

30 min，E3结合增强；

1 h，ubiquitination增加；

2 h以后，目标蛋白开始下降。

这样的顺序本身就比一个24 h终点有信息量。

如果蛋白已经大量下降以后才检测到磷酸化改变，那么把磷酸化放到降解上游就需要谨慎。

3、随后要干预激酶

如果已知上游Kinase，可以通过抑制剂、siRNA或其他方式降低激酶活性。

然后观察：

磷酸化是否下降；

E3与目标蛋白结合是否下降；

泛素化是否下降；

蛋白半衰期是否延长。

如果几个层级同步变化，就开始形成完整机制。

4、位点突变能够进一步证明phosphodegron

例如将候选Ser/Thr位点突变为不能发生相同磷酸化的形式。

随后比较WT和phospho-deficient mutant。

如果Mutant表现为：

磷酸化下降；

E3结合下降；

泛素化下降；

蛋白更加稳定；

就能够支持这个位点负责连接磷酸化和泛素化。

5、最后还要做功能回补

最重要的问题始终是：

这个PTM串扰对细胞到底有什么意义？

因此可以在内源目标蛋白降低以后分别回补WT和Mutant。

再观察增殖、迁移、炎症、屏障、细胞死亡或者当前疾病相关功能。

这样才能把：

磷酸化→泛素化→蛋白稳定性

进一步连到真实生物学表型。

1、两种修饰都可以发生在赖氨酸上

这使得乙酰化—泛素化特别适合研究位点竞争。

假设目标蛋白K200既可以发生acetylation，又存在ubiquitination证据。

如果K200乙酰化增加以后，目标蛋白泛素化下降、半衰期延长，就可以提出一个很自然的假设：

乙酰化可能保护该赖氨酸或者改变蛋白构象，从而降低泛素化和降解。

2、先做动态相关还不够

可以首先检测：

Ac-Protein；

Ub-Protein；

Total Protein。

如果发现：

乙酰化上升；

泛素化下降；

蛋白量升高；

这只是第一层现象。

还需要继续证明两种修饰之间存在因果关系。

3、干预乙酰转移酶或去乙酰化酶

例如提高目标蛋白乙酰化以后，观察泛素化是否同步下降。

反过来降低乙酰化以后，泛素化是否增加。

如果两种方向都成立，竞争关系会更加可信。

4、还要排查E3是否直接受到影响

一个常见误判是：

HDAC inhibitor处理以后，目标蛋白乙酰化升高，同时泛素化下降。

于是直接认为乙酰化和泛素化竞争。

但HDAC inhibitor可能同时改变E3 ligase表达或者活性。

因此还需要检测：

目标蛋白与E3之间的结合有没有变化；

E3本身有没有变化；

蛋白酶体系统有没有整体改变。

5、位点验证是这一类机制的关键

如果最终定位到某个K位点，可以进一步进行位点突变。

但需要特别谨慎解释。

因为一个K→R突变，同时会阻止这个赖氨酸上的多种潜在修饰。

所以K→R以后蛋白变稳定，并不能自动证明：

“乙酰化保护了这个位点。”

还需要结合乙酰化、泛素化本身的直接检测以及相应酶的干预。

1、O-GlcNAc和磷酸化都可以发生在Ser/Thr

这给两种修饰提供了天然的串扰基础。

如果同一个Ser/Thr位点既可以O-GlcNAcylation，又可以phosphorylation，那么理论上两者无法在同一时刻占据同一残基。

但真实情况比“一个升、另一个就降”复杂很多。

2、两种修饰可能发生在邻近位点

例如S100发生O-GlcNAcylation。

S102发生phosphorylation。

两者虽然没有直接抢同一个位点，但S100的糖基化可能通过空间位阻或者构象变化影响S102附近激酶结合。

因此最终仍然出现负相关。

3、也可能出现正向协同

某个O-GlcNAc修饰可能稳定蛋白构象，反而促进附近磷酸化。

或者O-GlcNAc调节某个激酶、磷酸酶本身，间接改变大量磷酸化。

所以实验结果如果出现：

O-GlcNAc升高；

phosphorylation也升高；

并不意味着实验失败。

它可能代表另一种串扰模式。

4、需要把OGT/OGA和Kinase/Phosphatase两端都考虑进去

O-GlcNAc主要受到OGT和OGA调节。

磷酸化则受到激酶和磷酸酶调控。

如果准备证明二者直接作用于同一个目标蛋白，最好不要只用全局O-GlcNAc调节剂。

还需要进一步观察目标蛋白本身的O-GlcNAc变化、磷酸化变化以及对应位点。

5、位点突变同样要注意“双重失活”

如果一个Ser位点同时可能发生O-GlcNAc和phosphorylation。

把S→A以后：

O-GlcNAc没有了；

phosphorylation也没有了。

所以单靠S→A无法判断最终表型究竟来自哪一种修饰消失。

这也是为什么PTM串扰研究必须把修饰酶、位点和功能实验放在一起解释。

1、SUMO化并不一定意味着蛋白稳定

很多人会下意识把泛素化和蛋白降解联系起来，而把SUMO化理解成另一套独立调控。

实际上两者之间存在非常直接的连接。

2、poly-SUMO可以成为另一类E3的识别信号

一些SUMO-targeted ubiquitin ligase，也就是STUbL，能够通过SUMO-interacting motif识别poly-SUMO修饰的蛋白。

RNF4就是非常经典的一类STUbL。

目标蛋白先发生SUMO化。

随后RNF4等E3识别这个SUMO信号。

再对目标蛋白进行泛素化。

之后可以进入蛋白酶体或者其他蛋白质量控制过程。

3、所以看到SUMO化升高、蛋白下降时，不要只研究SUMO本身

可以进一步检测：

目标蛋白的ubiquitination；

RNF4等候选STUbL与目标蛋白结合；

MG132能否恢复目标蛋白；

降低SUMO化以后泛素化是否下降。

4、这类机制非常适合DNA损伤和蛋白质量控制研究

很多染色质相关蛋白在受损以后，需要快速从DNA或者染色质结构上移除。

SUMO—ubiquitin串扰可以形成一个非常有效的识别和清除系统。

因此如果研究DNA损伤、复制压力、蛋白聚集或核内蛋白稳态，这类机制特别值得关注。

1、棕榈酰化非常适合研究蛋白定位

S-palmitoylation通常发生在半胱氨酸残基上。

加入脂质基团以后，蛋白疏水性和膜亲和能力会发生变化。

因此棕榈酰化经常与：

膜定位；

膜内运输；

蛋白稳定性；

蛋白互作

相关。

2、一个蛋白位置变了，它接触到的修饰酶也会跟着变

例如Protein A只有在质膜附近才能接触Kinase B。

如果Protein A棕榈酰化下降，它大量留在胞质。

这时即使Kinase B活性完全正常，Protein A的磷酸化仍然可能下降。

于是形成：

Palmitoylation↓→膜定位↓→Phosphorylation↓→信号下降。

3、所以两种PTM之间不一定存在直接化学作用

研究时需要特别检查亚细胞定位。

可以做：

膜浆分离；

免疫荧光共定位；

膜蛋白相关检测。

如果恢复膜定位以后，后续磷酸化重新出现，就能够说明棕榈酰化通过空间位置控制另一种修饰。

4、棕榈酰化也可能进一步影响泛素化和稳定性

蛋白进入不同细胞区域以后，能够接触的E3或者DUB也会改变。

因此棕榈酰化增加以后：

有的蛋白更稳定；

有的蛋白反而更容易被降解。

结论不能预设。

真正需要结合半衰期、泛素化和亚细胞定位一起判断。

1、赖氨酸是PTM竞争非常密集的位置

一个赖氨酸残基可以成为多种修饰的潜在底物。

所以现在做非组蛋白乳酸化时，一个很值得继续追的问题是：

这个K位点以前有没有被报道发生乙酰化、泛素化、SUMO化或者其他赖氨酸修饰？

2、如果同一个K位点具有多种修饰可能，就天然存在竞争假设

例如：

疾病环境乳酸升高；

Protein A的K150乳酸化增加；

同时Protein A泛素化下降；

蛋白半衰期延长。

这时可以提出：

K150 lactylation可能通过直接位点占用或者构象改变，阻止泛素化和蛋白降解。

3、但不能用K150R一个实验完成全部证明

因为K150R同时把这个位点上的：

乳酸化；

乙酰化；

泛素化；

以及其他赖氨酸相关PTM

都破坏了。

所以正确思路应该是：

先证明K150确实存在目标修饰；

再干预乳酸来源或者相关writer/eraser；

观察泛素化是否随之变化；

最后再使用位点突变加强因果证据。

4、代谢型PTM还要区分“底物增加”和“修饰系统变化”

乳酸化、乙酰化、琥珀酰化等修饰都与细胞代谢状态存在紧密联系。

因此修饰升高可能来自：

代谢物底物增加；

writer活性增强；

eraser下降；

蛋白所在细胞器发生改变。

如果只看到乳酸升高和Kla升高，就直接建立因果链，机制仍然不够完整。

很多科研用户会觉得：

想研究PTM crosstalk，是不是一定要先做磷酸化组、泛素化组、乙酰化组或者乳酸化组？

实际上并不一定。

如果已经有明确的目标蛋白和科学问题，完全可以从候选机制路线开始。

1、从“蛋白量解释不了功能”入手

例如：

Protein A总量没变，但酶活下降；

Protein B总量没变，但膜定位下降；

Protein C的mRNA没变，总蛋白却快速下降；

Protein D表达不变，但和Protein E的结合突然消失。

这些现象都非常适合从PTM进入。

2、从“单一PTM解释不完整”入手

例如已经证明：

Protein A磷酸化增加。

但为什么磷酸化以后蛋白越来越少？

这时自然进入泛素化。

已经证明：

Protein B乳酸化增加。

但为什么蛋白稳定性同时增加？

这时可以考虑泛素化或去泛素化。

这种从现有结果继续追第二层机制，往往比随机寻找一个全新PTM更有效。

3、从已有位点信息入手

可以通过公开数据库和已有文献查看目标蛋白上已经报道的：

phosphosite；

ubiquitination site；

acetylation site；

SUMOylation site；

O-GlcNAc site；

palmitoylation site。

重点关注同一位点或者空间上很接近的位点。

这类区域天然具有PTM串扰潜力。

4、从功能结构域入手

如果一个PTM位点刚好位于：

E3识别motif；

酶催化中心；

核定位序列；

膜结合区域；

蛋白互作结构域；

就比随机位点更值得优先研究。

因为它更容易解释后面的功能变化。

5、从异常实验结果反推

PTM研究里最值得重视的经常是“结果没有按照预期走”。

比如提高乙酰化以后蛋白反而下降。

抑制泛素化以后蛋白定位却变了。

抑制某个磷酸化以后蛋白稳定了，但下游信号仍然没有恢复。

这些异常往往提示还有第二种PTM参与。

1、第一层可以从IP-WB开始

例如想研究Protein A的乙酰化和泛素化。

可以先IP Protein A。

随后分别WB检测：

Acetyl-Lys；

Ubiquitin；

Protein A。

这样可以证明在同一批目标蛋白群体中存在两种修饰信号。

2、还可以做反向IP

例如IP泛乙酰化蛋白，再检测Protein A。

或者IP泛素化蛋白，再检测Protein A。

正向和反向结果一致，证据更加稳定。

3、需要注意普通IP不能证明“两种修饰同时存在于同一个蛋白分子”

这是一个非常关键的边界。

假设细胞里有100个Protein A。

其中50个被乙酰化。

另外50个被泛素化。

普通Protein A-IP以后，两种信号都会出现。

但这并不意味着同一个Protein A分子同时带有两种修饰。

所以如果课题真正需要证明同分子共存，还需要进一步设计更严格的实验。

4、同位点竞争更不能只靠普通IP证明

如果假设是K100乙酰化和K100泛素化竞争，那么化学上两种修饰不可能同时占据同一个K100。

这时研究重点应该变成：

当K100乙酰化增加以后，K100相关泛素化是否下降。

位点级证据比“总乙酰化和总泛素化反向变化”重要得多。

5、必要时可以使用针对性质谱确认位点

这并不意味着课题一定要做大规模修饰组学。

如果已经锁定一个候选蛋白和少数候选位点，可以采用针对性质谱验证具体修饰位点。

这样投入和问题都更加集中。

1、时间顺序是最基础的一层

如果PTM A在5 min出现。

PTM B到30 min才出现。

那么A位于B上游具有一定合理性。

如果顺序完全相反，就需要重新考虑机制。

2、单向干预是第二层

抑制PTM A。

观察PTM B。

如果B同步消失，说明B可能依赖A。

随后抑制PTM B。

观察PTM A。

如果A仍然存在，就进一步支持：

A→B。

3、双向干预比单向更有说服力

例如：

Kinase inhibition→phosphorylation↓→ubiquitination↓；

E3 knockdown→ubiquitination↓，但phosphorylation保持。

这种结果能够比较清楚地建立上下游顺序。

4、位点突变可以进一步确定依赖关系

如果磷酸化位点突变以后：

E3结合下降；

泛素化下降；

蛋白半衰期延长；

说明这个位点具有实际功能。

5、最终还需要做回补

例如内源蛋白敲低以后：

回补WT可以恢复正常调控；

回补磷酸化缺失Mutant以后，泛素化和降解无法恢复。

这时“PTM A控制PTM B”的因果关系会更加完整。

1、K→R并不是某一种赖氨酸修饰的专属突变

K→R确实能够阻止很多赖氨酸PTM。

问题恰好也在这里。

它同时可能影响：

ubiquitination；

acetylation；

lactylation；

SUMOylation；

methylation

等多种修饰。

所以K→R以后出现表型，只能证明：

这个赖氨酸很重要。

不能直接证明：

“这个表型一定来自乳酸化。”

2、K→Q也不能完全等同于乙酰化

K→Q经常被作为acetylation-mimic使用。

它可以在一定程度上模拟赖氨酸乙酰化造成的电荷变化。

但氨基酸替换和真正的动态共价修饰并不完全等价。

所以结果应该谨慎表述。

3、S/T→A同样会同时破坏多种潜在修饰

如果某个Ser同时存在磷酸化和O-GlcNAc潜力。

S→A以后两种修饰都会丢失。

因此不能根据一个S→A突变直接判断究竟是哪一条通路产生作用。

4、所谓phosphomimetic也存在边界

S/T→D/E可以模拟部分负电荷特征。

但真实磷酸基团在空间结构、电荷数量和蛋白识别上更加复杂。

因此S→D/E结果可以用于支持机制，但不应被当成与真实磷酸化完全等价。

5、位点突变还可能直接破坏蛋白结构

尤其是位点位于：

催化中心；

蛋白互作界面；

跨膜结构；

核定位序列

附近时。

Mutant功能改变可能来自结构破坏，而不完全来自PTM消失。

所以最好同时观察蛋白表达、定位和基础功能。

PTM研究最终不能停在“修饰变了”。

一定要继续回答蛋白功能到底变在哪里。

1、如果总蛋白发生变化，优先研究稳定性

可以做CHX chase观察半衰期。

再结合MG132等蛋白酶体相关干预和泛素化检测。

形成：

PTM变化→ubiquitination变化→half-life变化→protein abundance变化。

2、如果总蛋白不变但信号改变，优先研究定位

可以做免疫荧光、核浆分离、膜浆分离等。

例如：

Palmitoylation→membrane localization→phosphorylation→signal activation。

这种机制非常适合膜受体和信号蛋白。

3、如果蛋白量和位置都没变，继续看蛋白互作

PTM能够改变蛋白构象和结合界面。

可以通过Co-IP观察目标蛋白与关键partner之间的结合。

有时一个蛋白所有表达指标都正常，真正发生变化的是它已经无法进入原来的信号复合体。

4、酶类蛋白还需要直接看活性

代谢酶、激酶、磷酸酶和蛋白酶尤其如此。

修饰后蛋白量完全可能不变，但催化活性明显改变。

这时只做Western blot很容易错过真正机制。

5、最后必须回到细胞功能

根据具体研究方向，可以选择增殖、迁移、侵袭、吞噬、屏障、细胞死亡、炎症释放、免疫细胞活化或者其他真正与疾病相关的功能。

PTM只是调控层。

最终科研问题仍然应该落到：

它为什么改变疾病。

1、两种PTM同时升高，就直接写成存在串扰

只能证明相关。

2、PTM A升高、PTM B下降，就直接写竞争关系

可能来自两个完全独立的上游过程。

3、只做Pan-PTM Western blot

无法证明目标蛋白本身发生修饰。

4、只做目标蛋白IP一次，就证明同一蛋白分子同时存在两种PTM

普通IP无法提供这种分子级结论。

5、K→R以后表型消失，就直接定义某种赖氨酸修饰

K→R会同时影响多类PTM。

6、S→A以后表型改变，就直接证明磷酸化作用

同一位点还可能存在O-GlcNAc等修饰。

7、使用一个修饰酶抑制剂就完成机制证明

药理抑制可能同时影响大量底物。

8、只改变writer，不研究eraser

修饰水平由添加和去除共同决定。

9、只看修饰酶表达，不看酶活性或底物结合

蛋白表达量不能代表实际催化状态。

10、比较两组PTM时没有校正目标蛋白总量

如果处理组Target Protein本身增加两倍，IP以后修饰信号增加并不一定代表修饰比例升高。

11、MG132救回蛋白，就直接写成目标蛋白发生泛素化降解

MG132影响大量蛋白酶体底物，还需要目标蛋白泛素化和半衰期证据。

12、只做total ubiquitin，不区分泛素链类型

K48、K63及其他链型的功能可能完全不同。

13、只检测蛋白量，不看亚细胞定位

很多PTM主要改变定位。

14、只检测蛋白量和定位，不看互作

一些PTM真正改变的是复合体组装。

15、只检测PTM和下游通路，不做功能实验

机制最终没有落到真实细胞表型。

16、两个PTM所有指标都放在同一个24小时终点

缺少上下游时间信息。

17、位点预测出来以后直接全部突变

很容易造成大量低价值实验。

18、一次做五六个候选位点

最后形成排列组合，课题失去主线。

19、没有优先研究位于功能结构域附近的位点

大量实验投入在生物学意义很低的位点上。

20、只在过表达体系验证

过量蛋白可能改变酶、底物和修饰之间的真实比例。

21、IP条件过于温和，却要证明目标蛋白本身被某种修饰

共沉淀的结合蛋白也可能带来修饰信号。

必要时需要考虑更严格甚至变性条件的修饰IP。

22、没有考虑PTM变化其实来自蛋白所在细胞器改变

看起来是“修饰串扰”，真实中间机制可能是蛋白重新定位。

23、发现一种新PTM以后就不断补上游酶

却没有解释这个修饰究竟改变了蛋白什么性质。

24、为了创新强行增加第二种PTM

两种修饰没有明确生物学联系，最后机制反而变得松散。

如果现在准备围绕“不同翻译后修饰之间的相互作用”设计一个基础科研课题，可以按照下面这条路线推进。

第一步，先找到一个解释不了的蛋白功能异常。

例如目标蛋白总量下降、定位改变、活性下降或者互作异常。

先有明确的生物学问题。

不要为了做PTM而做PTM。

第二步，确定第一种PTM。

根据已有结果、目标蛋白结构、候选修饰酶和文献基础，确认目标蛋白确实存在第一种PTM变化。

这一阶段需要从Pan-PTM推进到Target Protein-specific PTM。

第三步，明确第一种PTM到底改变了目标蛋白什么性质。

先判断：

稳定性；

定位；

蛋白互作；

酶活；

构象或信号复合体。

只有这一层明确以后，第二种PTM才容易被找到。

第四步，从异常结果寻找第二种PTM。

例如：

磷酸化以后蛋白下降→考虑泛素化；

乙酰化以后蛋白稳定→考虑泛素化竞争；

棕榈酰化以后信号增强→考虑膜定位后的磷酸化；

SUMO化以后蛋白下降→考虑STUbL介导的泛素化；

乳酸化以后稳定性变化→考虑赖氨酸泛素化或者其他K修饰竞争。

第五步，证明两种PTM真的作用于同一目标蛋白。

通过Target Protein IP结合两类PTM检测建立基础证据。

必要时进一步进行位点级验证。

第六步，做时间序列。

判断两个PTM出现的先后顺序。

建立初步上下游关系。

第七步，做双向干预。

干预PTM A以后观察PTM B。

干预PTM B以后观察PTM A。

通过这种方式判断：

A→B；

B→A；

还是两者共同受到第三个上游因素控制。

第八步，进入位点。

优先选择功能意义明确的少数候选位点。

通过WT和Mutant验证PTM串扰是否依赖该位点。

第九步，加入修饰酶。

把Kinase、E3、DUB、acetyltransferase、deacetylase、OGT/OGA、ZDHHC等具体调节分子放进机制链。

此时重点应该证明：

修饰酶与目标蛋白之间存在功能联系；

而不是只证明修饰酶表达也发生变化。

第十步，验证蛋白功能变化。

根据课题判断：

half-life；

localization；

PPI；

enzyme activity

究竟哪一个是PTM串扰真正控制的环节。

第十一步，做回补实验。

例如：

降低内源Protein A；

分别回补WT和PTM-deficient mutant；

再观察第二种PTM、目标蛋白功能和细胞表型。

如果WT可以恢复，而Mutant无法恢复，机制因果关系会明显加强。

第十二步，回到疾病表型。

最终建立：

疾病环境→PTM A→PTM B→Protein function→Cell phenotype→Disease phenotype。

如果两种PTM之间还存在反馈，则可以进一步形成闭环。

第十三步，再考虑是否需要继续增加第三种PTM。

很多课题做到两个PTM已经足够。

只有当第二种PTM仍然无法解释后续现象时，再考虑第三层。

不要为了让机制看起来复杂，机械叠加修饰类型。

真正有创新性的PTM研究，核心并不是“修饰越多越好”。

更重要的是每增加一个修饰，都解决了上一层机制无法解释的问题。

蛋白翻译后修饰研究真正困难的地方，通常出现在从“发现修饰”推进到“证明功能”的阶段。

很多课题前期已经看到目标蛋白存在磷酸化、泛素化、乙酰化、乳酸化或者其他修饰变化，但后面不知道应该继续研究修饰酶、位点、蛋白稳定性还是其他PTM。

博恩生物可以根据现有结果和具体科学问题，协助从目标蛋白功能反推PTM研究路线。

在基础修饰验证方面，可以围绕目标蛋白设计IP-WB、Co-IP、Western blot、免疫荧光等实验，验证目标蛋白的磷酸化、泛素化、乙酰化、乳酸化、SUMO化及其他候选修饰。

对于泛素化研究，可以进一步结合MG132、CHX chase、E3连接酶和DUB相关干预，评价目标蛋白泛素化、半衰期和蛋白酶体降解，并根据项目需要进一步区分不同泛素链类型。

对于磷酸化研究，可以结合候选激酶、磷酸酶、位点突变和信号通路干预，进一步判断目标磷酸化发生的上游机制及其对蛋白功能的影响。

对于乙酰化、乳酸化及其他赖氨酸修饰，可以围绕目标蛋白IP、修饰水平、候选writer/eraser、代谢环境和位点突变建立机制，并进一步研究这些修饰是否与泛素化、SUMO化或其他赖氨酸修饰发生竞争。

对于棕榈酰化研究，可以结合相关生化检测、膜浆分离和免疫荧光，评价棕榈酰化对蛋白膜定位、稳定性和信号转导的影响，再根据结果继续研究磷酸化、泛素化等后续PTM。

对于O-GlcNAc和磷酸化串扰，可以从OGT/OGA、候选激酶、目标蛋白修饰和位点功能几个层面进行拆分，避免只根据全细胞O-GlcNAc和磷酸化变化判断直接竞争。

在蛋白稳定性方面，可以通过CHX追踪、蛋白酶体干预和泛素化检测，把PTM变化与蛋白半衰期联系起来。

在亚细胞定位方面，可以根据目标蛋白特点开展核浆分离、膜浆分离和免疫荧光共定位，帮助判断PTM是否通过改变蛋白位置进一步影响第二种修饰。

在蛋白互作方面，可以通过Co-IP等实验判断PTM是否改变目标蛋白与E3、DUB、激酶、受体或者其他关键partner之间的结合。

对于已经明确候选位点的项目，可以进一步设计WT和Mutant回补实验，并根据具体位点谨慎选择突变方式，避免把K→R、S→A等突变简单等同于某一种PTM的特异性缺失。

如果已经有一批初步数据，比如：

目标蛋白总量没有变化，但功能明显下降；

目标蛋白磷酸化升高，同时蛋白越来越少；

乳酸化升高以后蛋白稳定性明显增加；

棕榈酰化改变以后膜信号突然消失；

SUMO化升高以后目标蛋白反而快速降解；

这类结果其实都非常适合进一步反查PTM crosstalk。

方案设计本身不单独收费，通常与后续实验实施结合。

蛋白翻译后修饰研究真正容易做出创新的地方，往往已经不在于再找到一种“新的修饰”。

更值得追的是：

为什么一种修饰发生以后，另一种修饰也跟着变化？

两个修饰到底是竞争、协同还是前后接力？

第一种修饰有没有改变第二种修饰酶对目标蛋白的识别？

蛋白是不是因为修饰改变了位置，才获得了新的修饰机会？

最终改变的是蛋白稳定性、定位、互作还是活性？

当研究从“Protein A发生PTM A”，推进到“PTM A重新定义Protein A接受PTM B的方式，进而改变蛋白功能和疾病表型”，整个机制的层次就会明显提升。

这也是现在做蛋白翻译后修饰研究，最值得继续往下挖的一步。