DMM小鼠模型是骨关节炎候选药临床前研究中应用较多的创伤后退变模型。通过切断内侧半月板胫骨韧带，使膝关节力学稳定性持续下降，随后逐渐出现软骨蛋白聚糖丢失、软骨表面破坏、滑膜炎、骨赘形成以及软骨下骨重塑。对于需要观察长期结构保护的候选药，DMM比短周期化学诱导模型更容易提供连续的疾病进展窗口。

当候选物从普通小分子进一步扩展到AAV、siRNA、ASO、mRNA、基因编辑载体、间充质干细胞以及工程化细胞后，DMM实验最大的变化之一，就是对照组不能继续沿用“假手术组＋模型组＋给药组＋阳性药组”这一套简单结构。

原因很直接。一个核酸药物产生疗效，里面可能同时包含载体本身、核酸序列、递送材料和关节穿刺的影响；一个工程化细胞产品产生疗效，也可能同时来自细胞本身、工程改造产生的新功能以及注射载体。如果缺少相应对照，即使OARSI评分、Ⅱ型胶原或者疼痛行为明显改善，也很难判断真正发挥作用的是哪一层。

因此，核酸和细胞疗法的DMM实验，真正需要解决的不是“多加几个组”，而是把模型效应、给药操作、递送平台和有效载荷逐层拆开。只有这样，动物药效结果才能继续支撑机制判断、剂量优化和后续研发决策。

把这四层关系理清以后，后面的分组通常不会太复杂。真正容易出问题的，是为了控制动物数量而把平台对照删掉，最后得到一个“有药效但解释不清来源”的结果。

无论候选物最终属于核酸还是细胞疗法，都建议先把对照体系分成基础模型层、平台层和候选产品层。

基础模型层通常至少包括Sham组和DMM模型组。Sham动物接受关节切开及相应操作，但保留内侧半月板胫骨韧带，用于确认DMM是否形成预期退变。DMM模型组则建立完整DMM，并接受与候选治疗相匹配的基础处理。

平台层回答的是载体、递送材料或者普通细胞本身会不会产生疗效。例如AAV项目需要空载体或非功能性载体，LNP-siRNA项目需要与候选产品匹配的非靶向核酸递送系统，工程MSC则需要未经工程改造的同源MSC。

候选产品层才是最终药物，包括AAV-目的基因、靶向siRNA或者工程MSC。

如果研究目标包含明确的临床标准治疗对照，还可以增加药物参照组，但这一组承担的是“候选治疗与现有方案比较”的任务，不能替代平台对照。

一个比较清晰的基础结构通常是：

对于研发项目来说，这几组并不一定每一次探索性实验全部保留，但进入正式药效验证时，平台效应通常是核酸和细胞项目最不建议省掉的一层。

AAV在骨关节炎研究中很适合局部长期表达，可以用于过表达保护性蛋白、抑制特定靶点或者持续表达核酸调节元件。它的优势也是实验设计需要特别控制的地方：一次关节腔注射以后，表达可以维持较长时间，因此载体自身造成的差异同样可能长期存在。

1、空载体要尽量和治疗载体保持一致

如果候选产品采用某一特定血清型AAV、特定启动子和相同的表达框架，那么对照AAV最好保留相同衣壳、相同启动子、相同给药途径和相近病毒基因组剂量，仅去掉真正具有功能的目的序列，或者换成不产生药理作用的对照序列。

如果治疗组使用AAV9，而对照组使用另一种血清型；或者治疗组含有完整表达框架而对照组只有PBS，那么最终差异中就会混入病毒组织嗜性、免疫反应和转导效率的影响。

对于AAV过表达项目，常用逻辑可以设为DMM＋AAV-empty与DMM＋AAV-target；如果必须插入报告基因作为空载体，可以使用不影响OA病理的报告序列，但仍要考虑报告蛋白本身是否增加细胞负担。

2、RNA干扰类AAV最好使用非靶向序列

如果AAV表达shRNA、miRNA抑制元件或者其他RNA干扰结构，单纯空病毒仍然不够理想。治疗载体本身会持续产生RNA分子，对照组最好使用相同表达结构、长度和启动子，但序列不靶向小鼠已知基因。

这样能够同时控制AAV本身和RNA表达本身两个变量。

如果只比较AAV-shTarget与PBS，一旦看到软骨保护，很难区分是目标基因沉默产生作用，还是长期病毒转导改变了关节局部环境。

3、剂量必须按病毒颗粒而不是注射体积匹配

局部AAV研究经常出现一个容易被忽视的问题：对照病毒和治疗病毒注射体积一样，但实际病毒基因组数量不一致。对于关节腔这种容积较小的局部环境，病毒颗粒负荷本身就可能影响免疫和细胞反应，因此平台对照应尽量匹配vg剂量，而不只是匹配几微升注射体积。

如果正式实验设置低、中、高三个AAV剂量，平台对照通常至少需要与主要药效剂量相匹配。是否需要为每一个剂量分别设置空载体，则可以根据探索阶段还是确证阶段决定，避免动物数量无限扩大。

非病毒核酸产品最大的变量通常来自两个部分：核酸序列和递送系统。

如果将siRNA直接溶于缓冲液关节腔注射，控制相对简单；但真正进入研发阶段后，为了改善稳定性、细胞摄取和关节驻留，往往需要加入脂质纳米颗粒、聚合物、脂质体、微球或者水凝胶。此时递送材料已经成为候选产品的一部分。

1、非靶向核酸比单纯空载体更重要

以LNP-siRNA为例，较有解释力的对照并不是LNP空颗粒，而是“相同LNP＋非靶向siRNA”。

原因在于，治疗组实际承受的是“载体材料＋核酸负荷”，如果对照组只有空颗粒，核酸自身可能引起的先天免疫刺激、细胞应激或者理化性质变化没有得到控制。

因此最常见的核心比较应当是：

DMM＋LNP-non-targeting siRNA 对比 DMM＋LNP-target siRNA。

如果前期还需要确认LNP本身有没有明显关节效应，可以增加DMM＋LNP-only组。但正式项目不一定长期保留所有材料对照，前提是前期已经证明材料本身不会明显改变主要终点。

2、递送平台改变以后，对照也要跟着改变

同一个siRNA如果最初用普通LNP，后续换成关节靶向LNP或者缓释水凝胶，原来的对照数据不能直接继续使用。

因为递送系统改变以后，关节内驻留、软骨穿透、巨噬细胞摄取和系统暴露都有可能变化。此时新的平台已经成为药效的重要组成部分，应该重新设置匹配的非靶向核酸平台对照。

对于“靶向肽-LNP-siRNA”这类产品，如果研发重点还包括证明靶向修饰本身的价值，可以进一步增加未修饰LNP-siRNA组，用于回答“加了靶向结构以后到底提高了多少药效”。

这样分组以后能够依次得到三层结果：

普通递送系统有效多少； 靶向递送带来多少增量； 真正靶向核酸又带来多少增量。

这对于后续制剂优化比单纯得到一个“最终产品有效”的结果更有价值。

3、mRNA项目还要考虑蛋白表达时间

mRNA在关节内通常存在相对明确的表达窗口，因此实验不能只在终点检测软骨保护，还需要在早期增加局部表达动力学。对照mRNA应与治疗mRNA使用相同修饰方式、相近长度和相同递送系统，编码一个对OA病理无明显作用的蛋白。

如果给药频率需要根据蛋白表达持续时间确定，最好先完成小规模表达动力学，再决定每周一次、两周一次或其他给药间隔。直接照搬小分子给药频率，对mRNA项目意义并不大。

细胞疗法在DMM模型中的对照设计，比普通核酸药物更容易出现解释偏差。

以MSC为例，MSC本身就具有免疫调节、旁分泌和组织保护作用。如果进一步构建一种过表达抗炎蛋白的工程MSC，最终看到OARSI评分下降，真正需要回答的是：工程MSC是否明显优于普通MSC，而不仅仅是优于PBS。

因此，对于工程细胞，未经改造的亲本细胞通常是最关键的对照。

一个基础结构可以设置为：

DMM＋Vehicle DMM＋普通MSC DMM＋工程MSC。

如果工程化过程本身还使用病毒载体，可以进一步根据研究目的增加“空载体工程MSC”，也就是细胞经历完全相同的转导和筛选流程，但不表达有效功能分子。这样可以排除病毒转导、筛选过程或者培养条件变化造成的影响。

1、普通细胞和工程细胞的生产条件需要尽量一致

两组细胞最好来自相同来源、相同供体策略、相近传代次数、相同培养基和冻存复苏流程，同时在注射前检测活率和细胞数量。

如果普通MSC使用P3，而工程MSC因为构建过程已经培养到P7，即使后者疗效不同，也很难判断来自工程改造还是细胞老化和分泌表型变化。

对于异体细胞或人源细胞，还需要注意免疫背景。免疫完整小鼠中的异种细胞可能引起额外免疫清除，这种效应与临床同种异体产品的情况并不完全一样。模型选择和细胞来源必须在项目开始前统一考虑。

2、死亡细胞通常不需要作为常规主对照

有些项目会考虑设置热灭活细胞或死亡细胞组，用于证明活细胞才有疗效。这类对照可以回答特定机制问题，但并不是每一个正式DMM药效项目都必须加入。

如果研究假设涉及细胞存活、持续分泌或者植入时间，可以增加死亡细胞；如果主要目标只是比较普通MSC和工程MSC的增量价值，优先保证Vehicle、普通细胞和工程细胞三个核心组更有意义。

3、细胞疗法还要增加“存活与滞留”这一层终点

细胞项目不能只检测终点软骨病理。给药后细胞在关节内能存活多久、主要停留在哪里、什么时候大量消失，会直接决定给药频率和疗效解释。

如果工程细胞疗效持续8周，但细胞在关节内仅短期存在，那么后续就需要关注早期旁分泌重编程；如果细胞长期滞留，则要继续评价局部安全性和异常组织形成风险。

因此，细胞示踪并不是单纯为了“拍一张荧光图”，而是要服务于给药间隔和作用机制判断。

DMM本身已经通过手术破坏关节稳定性，如果后续每周或者每两周继续进行关节腔注射，重复穿刺会成为新的变量。

针头进入关节可能带来轻度机械损伤、局部炎症和关节液改变。如果治疗组接受多次关节腔注射，而模型组完全不接受任何注射，那么最终差异中就同时包含了药物和操作影响。

因此，关节腔项目的DMM模型组通常更适合作为Vehicle injection control，也就是在完全相同的时间点、相同针型、相同注射体积和相同操作条件下接受载体或缓冲液。

对于细胞疗法，Vehicle通常是细胞悬液所使用的缓冲液；对于核酸药物，则应尽量使用最终制剂的匹配溶媒。

重复给药项目还需要特别记录关节肿胀、感染、穿刺失败和异常出血。如果某些动物因为注射操作造成明显关节损伤，不能简单继续纳入软骨病理统计，因为这种额外损伤会放大DMM本身的疾病表型。

如果候选制剂采用水凝胶、微球或者其他长效载体，还需要判断载体是否长期留存在关节腔。此时Vehicle不能简单使用PBS，而应该使用不含有效核酸或细胞的匹配载体，否则无法排除材料本身带来的润滑、机械支撑或者局部免疫影响。

1、核酸和细胞项目不一定需要寻找一个“结构修饰阳性药”

目前骨关节炎仍缺少被广泛认可的结构修饰性标准药物，因此DMM结构保护研究中很难找到一个可以直接等价于候选核酸或细胞产品的阳性对照。

如果项目主要关注疼痛，可以增加临床常用镇痛或抗炎药作为功能参照，但这类药物即使明显改善疼痛，也不能要求它同步改善OARSI评分。反过来，一个真正具有软骨保护作用的核酸产品，也可能短期内对疼痛没有同等幅度的改善。

因此，阳性参照更适合作为某一类终点的系统有效性控制，而不是所有终点都要求和候选产品一一对应。

2、给药开始时间决定得到的是预防性还是治疗性结果

DMM术后早期就开始给药，很容易获得较明显的软骨保护，因为疾病结构损伤尚未完全建立。对于探索候选产品是否能够阻断早期病理过程，这种设计合理；如果研发目标是治疗已经形成的OA，则需要把给药时间向后推。

一般可以把术后较早给药用于验证早期干预能力，术后约4周开始则更接近已建立早期结构损伤后的治疗，而更晚时间点可以用于评价中度以上退变阶段的干预能力。具体时间仍应根据手术稳定性、动物年龄以及本实验室DMM自然病程确定，不能机械套用固定周数。

对于长效AAV和细胞疗法尤其需要注意这一点。如果术后当天或术后几天就注射，最终看到的可能主要是阻断模型建立；如果产品未来面向临床既有OA患者，这种设计的外推价值会受到限制。

3、主要终点必须提前确定

核酸和细胞项目很容易出现检测指标过多的问题。软骨、滑膜、疼痛、骨赘、软骨下骨、炎症因子、目的基因、细胞示踪全部都做，最后每一个终点都有一些变化，却没有一个清楚的主要结论。

正式研究更适合先确定一个主要药效目标。

如果定位疾病修饰，主要终点可以围绕软骨结构，例如OARSI评分和Safranin O/Fast Green病理；如果定位疼痛治疗，则应把负重、机械痛阈或者步态等功能指标提前定义为主要终点；如果候选产品专门靶向软骨下骨，则micro-CT和骨重塑指标应当进入更核心的位置。

1、AAV过表达类项目

如果目标是验证某个保护性蛋白长期表达能否延缓DMM骨关节炎，一个比较清楚的正式药效框架可以设置为：

如果需要做剂量关系，可以把AAV-target拆为低、中、高剂量，但不建议因此完全删掉AAV-empty。平台对照对于最终解释比增加一个额外候选剂量更加关键。

2、LNP-siRNA类项目

如果候选产品为关节腔注射的LNP-siRNA，更推荐使用非靶向siRNA作为核心平台对照。

如果前期怀疑LNP本身具有明显作用，可以额外加入LNP-only，但正式确证研究是否保留这一组，可以根据前期结果和动物数量重新判断。

3、工程MSC类项目

对于工程化MSC，普通MSC几乎是最有价值的对照之一。

如果工程化步骤可能明显改变细胞状态，还可以将Parent MSC进一步升级为“经过相同转导流程但携带空载体的MSC”。这样两组细胞的生产经历更加一致，最终得到的差异更接近目标工程模块本身的贡献。

DMM的核心病理驱动来自关节机械稳定性破坏，因此它特别适合评价创伤后OA、软骨退变、滑膜炎和长期结构保护。但一个核酸或细胞产品在DMM中有效，并不能自动证明它对所有OA类型都有效。

如果候选产品主要靶向软骨细胞分解代谢，而且未来适应症面向更广泛的原发性OA，那么DMM阳性后可以考虑增加老龄、自发性或代谢相关OA模型，判断疗效是否依赖手术性机械失稳背景。

如果候选产品的主要卖点是快速镇痛，第二模型可以选择疼痛表型更加明确、时间窗口较短的模型，用于验证镇痛作用是否能够跨越不同病理机制重复出现。

如果候选产品属于细胞治疗、组织修复材料或者长效基因治疗，而且未来临床定位强调软骨修复和结构改善，那么进入更高阶段后还需要考虑更大关节、更接近临床给药方式的动物模型。此时DMM承担的是机制和早期药效验证，而不是全部转化证据。

对于核酸和细胞疗法来说，真正高质量的DMM研究应当能够回答三个层次的问题：完整候选产品有没有药效，药效有多少来自载体或细胞平台，真正的功能序列或工程改造又贡献了多少增量。把这三层通过合理对照组拆开以后，DMM实验得到的结果才更容易继续服务于剂量选择、给药频率、产品优化以及下一阶段模型升级。