前言

在进行自噬研究时，WB 检测 LC3-I 和 LC3-II 几乎是必做的实验，那么，进行 LC3 检测时，需要注意哪些要点呢？你的实验方案真的没有问题吗？下面我们来具体看一下实验方案的设计易错点。

LC3: 从何处来？往何处去？

LC3/Atg8 被具有蛋白内切酶活性的 Atg4 在羧基端剪切，生成胞质 LC3-I。LC3-I 通过 Atg7 和 Atg3（分别对应 E1 和 E2 样酶）参与的泛素样反应，使 PtdEth（PE) 偶联，生成脂质化形式的 LC3，也称作 LC3-II，它可以附着到自噬体 (autophagosome) 的膜上，是自噬体的结构蛋白。在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的 LC3-II 被半胱氨酸蛋白酶 Atg4B 移除后回收，位于内膜的 LC3-II 则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。

LC3A/B/C 有种属细胞/组织分布特点

LC3/Atg8 被具有蛋白内切酶活性的 Atg4 在羧基端剪切，生成胞质 LC3-I。LC3-I 通过 Atg7 和 Atg3（分别对应 E1 和 E2 样酶）参与的泛素样反应，PtdEth(PE) 偶联，生成脂质化形式的 LC3，也称作 LC3-II，它可以附着到自噬体 (autophagosome) 的膜上，是自噬体的结构蛋白。在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的 LC3-II 被半胱氨酸蛋白酶 Atg4B 移除后回收，位于内膜的 LC3-II 则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。

哺乳动物 LC3 蛋白的四个亚型（LC3A, LC3B,LC3B2 和 LC3C），他们的表达因组织或细胞类型而异。如图 2 所示，在甲状腺（Thyroid，第一行）中，LC3B 的表达水平并不高，检测 LC3A 更为合适。所以，需要根据自己使用的细胞系或者组织的情况，使用合适的靶标抗体。当然，通过使用抗 LC3A/B 抗体，同时检测 LC3A 和 LC3B，可以大大增加实验的成功率。

LC3 的来去是一个动态过程——检测 PCR 意义并不大，做 wb 也不能只简单检测就了事

正如前言所述，LC3-I 和 II 存在一个生成-降解的动态过程。自噬小体有一个生成、融合、降解的过程，即「自噬流」。所以，单时间点 LC3-II 的表达改变并不能体现自噬的改变，需要使用一些阻断溶酶体降解的药物（如氯喹、巴佛洛霉素 A1 等），判断在干预手段下，细胞的自噬程度的改变。氯喹可以通过抑制溶酶体功能（比如升高它的 pH 值），抑制 LC3-II 的降解；巴佛洛霉素 A1 则是一种强效 V-ATPase 抑制剂，阻断溶酶体依赖的降解。在「堵漏」的前提下，根据一段时间内 LC3-II 的积聚程度，判断自噬的改变（图 3）。

LC3 检测的注意点

目前的 LC3 抗体所检测的抗原表位都位于 LC3 的 N 端，由于 PE 基团结合可能导致 N 端区域的构象变化，使得抗体对 LC3-II 的亲和性更高，所以 LC3-II 条带显色深并不能代表该样本处于高自噬状态。另外，LC3-I 对反复冻融更为敏感，也更易在 SDS 上样缓冲液中降解。基于以上两个原因，在半定量时，除了使用 LC3-II/LC3-I 的比值外，也有科学家使用 LC3-II 与管家蛋白（Housekeeping Protein）的比值进行半定量。

LC3 是一个膜相关蛋白

作为脂化和膜相关蛋白，在细胞裂解后，对其进行冰上短暂超声，促进蛋白的溶解，将 LC3 从膜上解离。

超声方法：使用 35%-40% 的  功率进行 3 次超声脉冲，每次超声时间 10 秒, 每次超声之间停顿 10 秒，不同的仪器可以调整 功率水平在 200W 左右。

如没有细胞超声仪，可使用 1 mL 注射器（带针头），通过反复抽吸的方式达到类似于超声的效果。

LC3-I 和 LC3-II 是小分子蛋白

LC3-I 的分子量约 16KD，由于 LC3-II 接合了 PE 基团，所以理论上，LC3-II 的分子量比 LC3-I 更高。但是，由于带负电的 PE 改变了 LC-II 的性质，使其疏水性更强，导致其在电泳中迁移率更高，所以，LC3-II 在电泳后，停留在了更小分子量（约 14KD）处。

小分子量、LC3-I 与 LC3-II 仅有 2KD 差异，在 WB 中需注意：

· 使用高浓度分离胶（～15%，确认 Tris 缓冲液的 pH 值）进行分离；

· 转膜时，使用小孔径 0.22um 转印膜，湿转 70V 1.5 h 即可。对于半干转（如 Trans-Blot Turbo System），则可使用 2.5A 7 min。

自噬是一个「流动」的过程，目前，检测自噬流的方法有很多，除了 Western blot 外，还有电镜、长寿命蛋白降解实验，mRFP-GFP-LC3 双荧光系统等等，每一种实验方法都有其优缺点，所以，需根据实验目的选择合适的实验方法，或者使用多个实验方法进行交叉论证，才能得到可靠的结论。