细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，也称初代培养。严格地说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1-4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA）处理，使之分散成单个细胞，加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。

原代细胞培养基由补充了适当的生长因子和细胞因子的基础培养基组成。细胞在细胞培养箱中生长并维持在适当的温度和混合气体中（对于哺乳动物细胞，通常为37°C，5％CO2）。培养条件根据细胞类型而广泛变化。生长培养基的pH，葡萄糖浓度，生长因子和其他营养物质的存在可能会有所不同，具体取决于细胞类型。在建立原代培养过程中，必须在生长培养基中加入抗生素以抑制从宿主组织引入的污染。抗生素可能包括庆大霉素，青霉素，链霉素和两性霉素B的混合物。但是，不建议长期使用抗生素，因为某些试剂（例如两性霉素B）从长期来看可能对细胞有毒。

常见的原代细胞类型：上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、神经元、星形胶质细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、滑膜细胞、毛细胞、血细胞、干细胞。

原代细胞 VS. 细胞系

连续细胞系已经获得了通过随机突变或通过故意修饰（例如癌症基因的人工表达）转化的癌细胞系中的无限增殖（永生化）的能力。连续细胞系通常比原代细胞更坚固，更易于操作。它们具有无限的增长潜力，是获取基本信息的快速简便方法。使用连续细胞系的一些缺点是它们是经过基因修饰/转化的，可以改变生理特性并且不代表体内状态，并且随着时间的流逝，这可能会进一步改变。

原代细胞培养技巧和窍门

1. 生长需求（Growth Requirements）

原代细胞可以悬浮培养或贴壁培养。一些细胞自然地悬浮在悬浮液中，而不附着在表面上（例如，来源于外周血的细胞）。也有一些细胞系经过修饰可以在悬浮培养中存活，它们的生长密度高于粘附条件所允许的密度。对于依赖贴壁的原代细胞，贴壁细胞（例如实体组织）需要一个表面才能在体外正常生长。这些细胞大多在没有涂层的扁平塑料容器中培养，但有时在微载体上培养，可以用细胞外基质蛋白（如胶原蛋白和层粘连蛋白）包被，以增加粘附特性并提供生长和分化所需的其他信号。细胞培养基由补充了适当的生长因子和细胞因子的基础培养基组成，细胞在细胞培养箱中生长，并维持在适当的温度和混合气体中（对于哺乳动物细胞，通常为37°C，5％CO2）。培养条件根据细胞类型而广泛变化，生长培养基的pH、葡萄糖浓度、生长因子和其他营养物质的存在可能会有所不同，具体取决于细胞类型。

在建立原代培养过程中，必须在生长培养基中加入抗生素以抑制从宿主组织引入的污染。抗生素可能包括庆大霉素，青霉素，链霉素和两性霉素B的混合物。但是，不建议长期使用抗生素，因为某些试剂（例如两性霉素B）从长期来看可能对细胞有毒。

分离后保留原代细胞的活力非常重要，因为它们中的大多数会经历衰老过程，并在一定数量的种群倍增后停止分裂。为了使细胞长期存活，必须具备出色的细胞培养操作技能以及适当的培养条件（即生长培养基、温度、气体混合物、pH、生长因子浓度、营养物质和葡萄糖等）。用于补充培养基的生长因子通常来自动物血液（血液来源的成分具有污染的可能性），建议尽可能减少或消除这些成分的使用，操作时也需要使用无菌技术。

2. 细胞融合（Cellular confluence）

细胞融合通常是指附着的细胞在培养容器中所占的百分比。例如，100％的细胞融合意味着培养皿表面被细胞完全覆盖，而50％的细胞融合意味着大约一半的表面被覆盖。跟踪和评估原代细胞培养是一个重要且必不可少的参数，因为各种细胞类型需要不同的融合终点，此时需要对其进行传代培养。

3. 继代保持（Maintenance and Subculture）

当分离的细胞附着在培养皿表面时，细胞的维持阶段开始。通常，培养开始后约需要24小时。当细胞达到所需的细胞融合百分比并活跃增殖时，就该进行传代培养了。这是在达到100％融合之前传代原代细胞培养的最佳时间，因为融合后的细胞可能会发生分化，并在传代后显示出较慢的增殖。

依附依赖性细胞以单层生长，需要定期用适当的培养基传代培养以维持指数生长。单层的继代培养涉及细胞间和细胞内表面间键的断裂，大多数粘附的原代细胞需要消化它们的蛋白质附着键，或者需要用低浓度的蛋白水解酶（例如胰蛋白酶/ EDTA）从单层或相关组织中分离出来。细胞解离并分散成单细胞悬液后，将它们计数并稀释至适当的浓度，然后转移至新鲜的培养容器中（培养基的组成取决于细胞类型而有所不同），在此处它们会重新附着并分裂。

4. 细胞计数（Cell counting）

血细胞计数器通常用于使用排阻染料锥虫蓝估计细胞数和确定细胞活力。血细胞计数器是相当厚的玻璃显微镜载玻片，带有矩形凹痕，可形成一个腔室。腔室上刻有垂直线的激光蚀刻栅格，并且精心制作了该设备。由线界定的面积和腔室的深度是已知的。因此，可以对特定体积的流体中的细胞数进行计数，从而计算出整个流体中的细胞浓度。

5. 冷冻保存和恢复（Cryopreservation and Recovery）

低温保存是使用低温保存结构完整的活细胞的过程。冷冻保存和融化原代细胞是必不可少的，以最大程度地减少每个过程中的细胞损伤和死亡。对于原代细胞，可通过使用冷冻保护剂（例如DMSO或甘油，在正确的温度和受控的冷冻速率下）实现。对于大多数原代细胞，可以在80％完全生长培养基的混合物中添加10％FBS和10％DMSO进行冷冻保存。冷冻过程需要以每分钟-1°C的速度缓慢进行，以最大程度地减少细胞内冰晶的形成。冷冻的培养物需要以液氮（-196°C）或低于-130°C的气相存储。

解冻冷冻保存的细胞是快速的过程，方法是将冷冻的细胞浸入37°C水浴约1-2分钟。注意不要在融化后离心原细胞（因为它们对冷冻保存恢复过程中的损伤极为敏感）。最好在融化后直接铺板细胞，并允许培养物在最初的24小时内附着。当启动冷冻保存的原代细胞培养时，必须在细胞附着后去除用过的培养基（因为DMSO对原代细胞，并可能导致解冻后活力下降）。

原代细胞培养过程中可能存在的错误

污染：转移主要组织进行培养时需要注意避免污染。

pH值变化：这可能是由于培养基中的盐分不正确，细菌或真菌污染，碳酸氢盐缓冲液不足，二氧化碳张力不正确等引起的。

粘附性不足（细胞不贴壁）：培养基中不含附着因子（attachment factors）或附着因子不足，培养皿或培养基污染，细胞被胰蛋白酶过度消化等。

生长缓慢：原因包括培养基的pH值变化，必需的促进生长的成分/因子耗尽，低污染，试剂储藏不当等。

细胞死亡：温度波动，二氧化碳含量过低，在融化和/或冷冻保存过程中细胞受损，有毒代谢产物浓度增加，培养基中的渗透压失衡导致细胞存活率降低。

沉淀（pH不变）：由于使用了冷冻培养基，在pH不变的培养基中可能会出现沉淀，残留的磷酸盐残留在用洗涤剂洗涤时可能会沉淀出粉末状的培养基成分。

细胞结块（细胞不贴壁且结块）：悬浮细胞可能由于钙、镁离子的存在（贯流时应使用不含钙、镁离子的D-Hank’s缓冲液（D-HBSS），而不能选择含有钙、镁离子的HBSS或可能含有钙、镁离子的PBS缓冲液）或细胞裂解及DNA释放（过度用蛋白水解酶消化）而结块。

诱导变异性：多种试剂和培养基会诱导原代细胞的数据产生变异，研究者的处理手法也可能导致原代细胞的数据产生变异。

对于原代细胞认识的错误

错误1：一小管原代细胞在水浴中解冻一段时间

纠正＃1：原代细胞对解冻过程非常敏感，因此将小瓶置于37℃水浴中，保持并轻轻旋转直到内容物刚刚解冻是很重要的。然后应立即从水浴中取出小瓶，并转移到无菌操作台。确保您的培养瓶在解冻前已经准备就绪，以便可以立即用于接种细胞，并置于培养箱中。

错误2：解冻小瓶后直接离心原代细胞

纠正＃2：我们不建议在解冻后离心细胞，因为离心程序比少量的DMSO残留更有害。记住，在恢复原代细胞后的第二天更换培养基以去除任何残留的DMSO。

错误3：允许原代细胞变得过于融合

纠正＃3：当生长至100％汇合时，原代细胞可以变得衰老。记住，原代细胞不是100％纯，因此重要的是尽量减少污染细胞的生长。我们建议在细胞达到90-95％融合时，对原代细胞进行传代培养。

错误4：传代原代细胞时过度胰蛋白酶消化

纠正＃4：当细胞传代时，使用低浓度的胰蛋白酶并在显微镜下密切监测细胞。此外，记得在胰蛋白酶消化后完全中和细胞中的胰酶，因为任何活性的胰蛋白酶都将损伤细胞。我们特别推荐专门为原代细胞配制的胰蛋白酶中和溶液（Cat＃0113），但也可以使用10％血清或大豆胰蛋白酶抑制剂（Cat＃0173）。

错误5：原代细胞可以很容易地重新冻存

纠正＃5：通常我们不推荐重新冻存原代细胞，因为这可以促进细胞衰老和/或导致功能变化。原代细胞非常敏感，重新冻结可能导致细胞死亡或损伤。

错误6：原代细胞可以无限的增殖

纠正＃6：与细胞系不同，原代细胞具有有限的扩增能力。我们建议尽早使用原代细胞进行实验以防止遗传漂移。此外，如果你正在使用一个增值困难的细胞类型，你应该密切监测细胞形态，因为少量混杂的细胞（如成纤维细胞）可能随着时间的推移，大量生长从而成为主要细胞。