01 背景

动脉粥样硬化（AS）是一种临床疾病，由于脂肪物质、胆固醇、巨噬细胞、细胞废物、钙和其他物质的积累而导致动脉壁变厚，从小减少动脉血流量。动脉粥样硬化是心血管疾病的核心，导致心肌梗死、中风和周围血管疾病。这些疾病在全世界是主要的死亡原因，动脉粥样硬化机制尚不清楚。但是，各种细胞和动物模型已经显著地提高了我们对动脉粥样硬化相关机制的理解。本文主要介绍那些已被用于研究动脉粥样硬化的动物模型以及细胞模型。

02 细胞模型

细胞模型对于研究疾病的特定分子机制至关重要。通常用于AS研究的细胞类型包括内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞。AS始于内皮功能障碍，这导致内皮细胞释放粘附因子和趋化因子，招募大噬菌体在内膜中积累。巨噬细胞诱导生长因子和趋化因子的释放，以促进平滑肌细胞的增殖和迁移。同时，巨噬细胞吞咽脂质会导致泡沫的形成。表1介绍了不同细胞类型常用原代细胞、细胞系和一些应用。表1 动脉粥样硬化研究中常用的细胞类型。

体外培养可用来构建泡沫细胞模型的细胞包括RAW264.7、THP1及U937等。这些细胞均为肿瘤细胞，本身具有传代稳定的特性，对培养基条件要求不高，易于培养，均适合用于构建泡沫细胞模型。泡沫细胞模型建立的造模方法多采用ox-LDL刺激。

方法：采用50 μg/mL ox-LDL刺激RAW264.7细胞48 h，油红O染色显示细胞体积增大，呈圆形、短梭形或不规则形，胞浆内大量红色或暗红色圆形脂滴，细胞泡沫化显著。

03 动物模型

用作AS模型的动物须易于获得，能以合理的成本维护，容易处理并具有明确的遗传特征。目前，常用于建立AS模型的动物包括大鼠、小鼠、小型猪和家兔等，各有其优缺点。

基因工程小鼠模型

尽管小鼠模型有其局限性，但其仍然是动脉粥样硬化模型的首选物种。基因操作的便利性允许转基因，基因敲除和敲入以及条件性敲除。小鼠最常用的两种动脉粥样硬化模型分别是ApoE-/-模型和LDLR-/-模型。优点：基因工程建模具有简单、方便、快速、高效的优点，可以快速有效地制备需要的转基因型小鼠。缺点：小鼠和人类之间的脂质代谢存在显著差异，与人类相比，正常小鼠缺乏胆固醇脂转移蛋白（CETP），血浆中的胆固醇水平通常较低，形成的AS病变也不具有厚的纤维帽。ApoE-/-模型：ApoE是血液中最重要的载脂蛋白，介导了血浆脂蛋白的运输与清除，当小鼠缺失ApoE时，其血液中总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）含量都会增加，增加了小鼠AS的发生风险。apoE-/-模型的优点是，即使血浆胆固醇水平在300-500 mg/dL之间，复杂的血管病变也很容易发生[4]。在饲喂普通饲料时，在8至10周龄时出现泡沫细胞病变，15周后出现中间病变，包含梭形细胞（主要是SMC），20周后，纤维斑块明显包含SMC、细胞外基质和一个覆盖的纤维帽。饲喂高脂肪、高胆固醇的西方型日粮（WTD，通常为0.2%胆固醇，21%乳脂）可显著加速动脉粥样硬化的发生速度，导致血脂水平显著升高。LDLR-/-模型：LDLR是一种广泛存在于血浆中的TC运输蛋白，参与介导LDL和VLDL的清除，小鼠缺失LDLR会导致其体内中间密度脂蛋白（IDL）、LDL和乳糜微粒（CM）浓度提升，同时患上AS的风险也显著升高。使用普通饲料喂养LDLR-/-小鼠4个月后进行病理检测，发现纤维帽和纤维斑块形成。高脂饮食时，LDLR-/-小鼠会表现出更大且更晚期的AS斑块，高脂伴胆酸饮食的LDLR-/-小鼠大约6周后可于主动脉弓等处发现广泛AS斑块。表3 常见的基因工程动脉粥样硬化小鼠模型的优缺点。

高脂、高胆固醇饲料诱导法

方法：使用高脂、高胆固醇饲料（15%脂肪，1.25%胆固醇和0.5%胆酸）饲喂6-8周龄C57BL/6J小鼠，14周后出现高胆固醇血症（约200 mg/dL），形成散在脂肪条纹病变[5]。高脂、高胆固醇饲料饲喂ApoE-/-小鼠相结合可以缩短造模时间。优点：饲料诱导造模方法简单，成本低，可操作性强，适合大规模建立AS模型，成为了小鼠最常见的一种AS建模方法。缺点：斑块形成的时间不确定，部分小鼠建模可能时间过于漫长，超过20周才能完成AS建模。

动脉钳夹术法

手术动脉钳夹法的原理是机械压迫阻断动脉正常供血，导致局部血管缺血缺氧，颈动脉内膜损伤，引发炎性反应，进而促进AS的发生。方法：使用血管钳夹住大鼠一侧颈动脉20 min，手术后以高脂饲料喂养，6周时大鼠动脉内膜便有明显增厚，大量泡沫细胞聚集的现象，10周时形成典型纤维帽，成功建立大鼠AS模型。优点：能够人为控制AS的形成或病变部位，比较有利于对AS的并发症脑卒中的研究。缺点：对实验人员的操作技术要求较高，且手术中的不稳定因素较多，在大鼠造模中的个体差异较大，不易形成稳定的AS病变和统一的AS模型。

球囊损伤术法

球囊损伤术是制备血管损伤后再狭窄模型的常见方法，此方法的主要操作是将一定直径大小的球囊放入动脉血管后充盈球囊，通过反复拖拉充盈后的球囊造成动脉血管内皮细胞损伤，造成内皮细胞的即刻脱落，弹力板及中膜严重损伤，引起局部血管狭窄。方法：将充满生理盐水的塑料球囊导管自大鼠颈外动脉进入胸主动脉，向外拉至颈外动脉再进入胸主动脉，反复3次，再喂以高脂、高胆固醇饮食8周后，可以出现明显动脉粥样硬化病变。注意事项：注意选择内径大小适宜的球囊，牵拉过程中速度、力度的把握以及对球囊扩张压力的控制。在球囊损伤手术之后的3-5 d需密切观察动物状态，还需腹腔注射青霉素钠防止术后感染，造成不必要的死亡与损伤。

免疫损伤法

免疫损伤对于AS的影响较大，研究人员可将免疫损伤为切入点制作动物模型。常用的免疫刺激剂有肺炎支原体、幽门螺杆菌、EB病毒、巨细胞病毒、脂多糖等，它们可以诱导免疫反应的发生、发展。

接下来为大家详细介绍下ApoE敲除小鼠制作动脉粥样硬化模型的原理、方法、检测指标。原理：ApoE是极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein, VLDL)和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL) 的组成部分，参与胆固醇的运输。和人的脂蛋白谱相反，小鼠体内HDL较高，而低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL) 含量较低，其胆固醇主要存在于HDL中。敲除ApoE基因后，胆固醇转而主要分布于VLDL中，其携带的大量胆固醇无法被细胞表面脂蛋白受体结合后降解，发生蓄积导致动脉粥样硬化。研究表明ApoE-/-小鼠可自发形成高胆固醇血症(300-500 mg/dL)，并在正常饮食条件下发生显著的动脉粥样硬化病变。而高脂肪/高胆固醇的致动脉粥样硬化饮食会使血浆胆固醇水平升高超过1000 mg/dL，加速动脉粥样硬化进程。此类小鼠的病变部位主要发生于主动脉根部、主动脉弓、无名动脉、主动脉分支及肾动脉分叉。

方法：

动物：ApoE敲除小鼠、5周龄、雄性

饲料：常用D12108C或D12079B

造模过程：

1. 适应性喂养一周；

2. 小鼠禁食一晚；

3. 更换成D12108C或D12079B饲料；

4. 继续饲养12周，期间每3天更换一次饲料；

5. 12周后解剖小鼠即可观察到动脉粥样硬化形成

检测指标：

1. 主动脉大体油红O染色；

2. 主动脉根部做冰冻切片后油红O染色、Masson染色、天狼星红染色、免疫荧光染色（α-SMA和CD68等）；

3. 血清生化指标检测：TC、TG、HDL、LDL含量。

4. 

5.