导读

一、从差异基因到机制入口：先判断目的蛋白能不能直接作为机制主体

二、机制设计的主线：为什么优先围绕通路外围蛋白，而不是直接围绕核心蛋白

三、当目的蛋白本身没有明确功能时：从 IP-MS 到外围蛋白筛选的标准路线

四、真正的机制构建：围绕“目的蛋白—外围蛋白—核心蛋白”的动作分类来设计

4.1 形成复合体或局部装配平台

4.2 竞争性占位，限制外围蛋白接触核心蛋白

4.3 稳定外围蛋白，保护其不被降解或错误分选

4.4 招引第三者蛋白，形成三级功能复合体

4.5 改变外围蛋白定位，建立新的亚细胞信号微域

4.6 改写外围蛋白介导的内吞—回收—降解命运分叉

4.7 改变外围蛋白聚簇、驻留时间或凝聚体组分

4.8 通过外围蛋白重塑胞外通讯或受体起始条件

五、从机制反推表型：当目的蛋白本身没有功能时，如何结合通路属性和亚细胞定位设计表型

5.1 从通路属性反推表型

5.2 从亚细胞定位反推表型

5.3 从“动作类型”反推最优实验终点

5.4 从机制到表型的实操设计顺序

六、研究方案整合：从差异基因到表型闭环的标准路线

附录A 常见80个通路中核心蛋白与推荐外围蛋白清单

附录B 根据研究目的推荐实验平台与配套应用场景指南

附录C 相关生信工具网站与指导性使用建议

一、从差异基因到机制入口：先判断目的蛋白能不能直接作为机制主体

拿到组学数据后，真正决定机制设计方向的第一步，不是先看它富集到了哪条通路，也不是先看文献里谁最热门，而是先判断目的蛋白本身有没有足够明确、足够可直接展开的功能属性。

如果目的蛋白本身具有明确功能，那么后续机制可以直接围绕本体功能展开。例如，目的蛋白本身是激酶，就可以优先围绕它磷酸化了谁、改变了谁的活性或定位来设计；如果本身是磷酸酶，就围绕它去磷酸化了哪个活化节点来设计；如果本身是 E3 泛素连接酶，就围绕它促进了哪个蛋白的泛素化、降解或分选来设计；如果本身是去泛素化酶，就围绕它稳定了哪个关键蛋白来设计；如果本身是蛋白酶，就围绕有限蛋白水解、活性片段释放和跨区室信号转导来设计；如果本身是转录因子，就可以直接从染色质占位、转录复合体重组和下游转录程序重塑入手。

如果目的蛋白本身没有明确功能，或者虽然有注释，但不足以支撑一篇机制文章的主轴，那么机制入口就不能再放在“它自己会做什么”上，而应转到“它和谁结合、它把谁带到了哪里、它改变了谁的动作”上。此时，目的蛋白本身不是通路的直接执行者，而更像是通路外围层的组织者、限制者、稳定者或重定向者。后续机制构建的重点，也不再是目的蛋白本体，而是它所改写的外围蛋白行为。

二、机制设计的主线：为什么优先围绕通路外围蛋白，而不是直接围绕核心蛋白

直接围绕核心蛋白设计机制，通常容易落入四类常见问题。

第一，核心蛋白研究过于拥挤。越是经典通路，越是核心节点，已有研究越密集。此时即便目的蛋白确实影响了这个核心节点，文章也容易停留在“再次证明某通路被激活或抑制”的层面，难以形成新的动作层、结构层和时空层内容。

第二，核心蛋白连接的输入和输出过多。核心节点一动，常常会同时带出增殖、凋亡、迁移、代谢、炎症和免疫多个方向，结果是信号很强，但机制不聚焦，最后难以形成一条单链闭环。

第三，直接围绕核心蛋白展开，往往只能写到“表达改变—通路改变”的平面层面，难以下沉到真正体现文章深度的局部复合体装配、膜面聚簇、亚细胞定位、内吞分选、回收与降解命运分叉、细胞器接触位点和局部微域等层级。

第四，很多本身没有明确功能的目的蛋白，并不会直接控制核心蛋白，而是先通过结合外围蛋白，改写外围蛋白接触核心蛋白的方式，再间接改变整个通路的输出。此时，如果仍然强行从核心蛋白写起，前半段会缺失最关键的因果桥梁。

因此，真正适合承载机制创新的，往往不是通路最中心的位置，而是外围层。外围蛋白包括支架蛋白、适配蛋白、内吞分选蛋白、回收与降解调控蛋白、泛素化和去泛素化因子、亚细胞锚定蛋白、核转运蛋白、细胞器接触位点蛋白、胞外诱饵和膜面聚簇组织蛋白。外围蛋白所决定的，不只是通路开或关，而是信号从哪里进入、以什么复合体进入、在什么位置停留多久、最终被导向回收还是降解、以及最后偏向什么输出。

三、当目的蛋白本身没有明确功能时：从 IP-MS 到外围蛋白筛选的标准路线

当目的蛋白本身没有明确功能时，IP-MS 往往不是补充实验，而是机制设计的起点。

第一步，是确认目的蛋白所在区室。要先判断它更可能位于胞质、膜面、内体、回收内体、线粒体、内质网、细胞核、胞外或细胞器接触位点。定位信息决定后面筛选互作蛋白时的优先级。膜面和内体定位的目的蛋白，更应优先关注受体伴侣、内吞接头、回收和分选蛋白；核内定位的目的蛋白，更应优先关注核转位、共激活、共抑制和染色质装配蛋白；细胞器定位的目的蛋白，则更应优先关注接触位点、局部翻译、稳态维持和运输蛋白。

第二步，是做 IP-MS 后对互作名单进行机制化分层，而不是只按丰度排名。最值得优先进入机制验证的，不一定是最强互作蛋白，而通常是最能解释“外围动作”的蛋白。优先级可放在以下几类：支架/适配蛋白、膜面聚簇与内吞分选蛋白、回收与降解命运调控蛋白、泛素化与去泛素化相关因子、核转运与亚细胞锚定蛋白、细胞器接触位点蛋白、胞外诱饵与受体伴侣蛋白。

第三步，是把问题从“目的蛋白是否影响通路”改写为“目的蛋白通过哪个外围蛋白，以什么具体动作，改写了核心蛋白的接线方式、时空位置或持续时间”。这一步一旦明确，后续实验路径就会大幅聚焦。

四、真正的机制构建：围绕“目的蛋白—外围蛋白—核心蛋白”的动作分类来设计

4.1 形成复合体或局部装配平台

这一类机制中，目的蛋白本身不直接承担经典催化功能，而是与外围蛋白结合后，促进局部装配平台形成，使核心蛋白或核心过程能够被更高效地接入。

相关文献：Hsu JW, Bai M, Li K, et al. The protein kinase Akt acts as a coat adaptor in endocytic recycling. Nat Cell Biol. 2020;22(8):927-936.

这篇文献报道，Akt 在内吞回收过程中不仅表现为经典激酶，还作为 ACAP1 包被复合体的共适配因子，参与货物蛋白识别和回收装配。这里如果按“目的蛋白—外围蛋白—核心蛋白”结构拆解，目的蛋白是 Akt，外围蛋白是 ACAP1，核心蛋白/核心过程是 clathrin coat-dependent cargo recycling machinery，目的蛋白介导的动作是与外围蛋白共同形成局部装配平台，增强货物进入回收通路的能力。

这一类机制更适合出现在胞质、膜周、内体和 recycling endosome 定位的目的蛋白上。实操上，优先结合共定位、Co-IP、膜面蛋白追踪、内吞回收测定和结构域截短实验来验证。

4.2 竞争性占位，限制外围蛋白接触核心蛋白

这一类机制中，目的蛋白本身没有明确执行功能，但通过优先占住外围蛋白，阻断外围蛋白与核心蛋白之间的连接，导致核心通路接入受限。

相关文献：Adriaenssens E, et al. Control of mitophagy initiation and progression by the TBK1 adaptors NAP1 and SINTBAD. Nat Struct Mol Biol. 2024.

这篇文献报道，NAP1 和 SINTBAD 通过与 OPTN 竞争 TBK1，限制 OPTN 介导的线粒体自噬起始。按结构拆解，目的蛋白是 NAP1 或 SINTBAD，外围蛋白是 OPTN，核心蛋白是 TBK1，目的蛋白介导的动作是竞争性占位，限制外围蛋白与核心蛋白形成起始复合体，从而抬高通路启动阈值。

这一类机制更适合定位在胞质、线粒体表面、受体尾部附近或核内复合体附近的目的蛋白。实操上，要把“目的蛋白—外围蛋白”互作和“外围蛋白—核心蛋白”互作分开验证，并增加竞争性 Co-IP、剂量依赖和互斥结构域分析。

4.3 稳定外围蛋白，保护其不被降解或错误分选

这一类机制中，目的蛋白的价值不在于激活，而在于保护。它通过与外围蛋白结合，阻止外围蛋白被送往降解路径或错误分选路径，从而维持外围蛋白持续作用于核心通路。

相关文献：Burr ML, Sparbier CE, Chan YC, et al. CMTM6 maintains the expression of PD-L1 and regulates anti-tumour immunity. Nature. 2017;549(7670):101-105.

这篇文献报道，CMTM6 与 PD-L1 结合，并在质膜和回收内体中阻止 PD-L1 被送往溶酶体降解。按结构拆解，目的蛋白是 CMTM6，外围蛋白是 PD-L1，核心蛋白是 PD-1 免疫检查点轴中的受体配体抑制界面，目的蛋白介导的动作是稳定外围蛋白，保护其不被溶酶体降解，并维持其表面功能输出。

这一类机制多见于膜面、内体、Golgi 和溶酶体相关定位的目的蛋白。实操上应优先安排 CHX chase、泛素化检测、溶酶体/蛋白酶体抑制剂救援、表面蛋白流式和动态共定位实验。

4.4 招引第三者蛋白，形成三级功能复合体

这一类机制中，目的蛋白的核心价值不是简单与外围蛋白结合，而是在结合外围蛋白后进一步招引第三者蛋白，形成具有推进作用的三级功能复合体。

相关文献：Adriaenssens E, et al. Control of mitophagy initiation and progression by the TBK1 adaptors NAP1 and SINTBAD. Nat Struct Mol Biol. 2024.

这篇文献报道，NAP1 和 SINTBAD 除了在前期限制 OPTN-TBK1 连接外，在后续阶段还能促进 TBK1 与 NDP52、FIP200 等因子建立联系，推动线粒体自噬持续推进。按结构拆解，目的蛋白是 NAP1 或 SINTBAD，外围蛋白是 NDP52，核心蛋白是 TBK1-FIP200 参与的自噬推进模块，目的蛋白介导的动作是先结合外围蛋白，再招引第三者蛋白，形成推进阶段的三级功能复合体。

这一类机制更适合具有阶段性动态的系统，如自噬、DNA 损伤修复、受体内吞分选和核内转录复合体转换。实操上要增加时间维度，做分阶段 Co-IP、时序定位和桥接依赖性 rescue。

4.5 改变外围蛋白定位，建立新的亚细胞信号微域

这一类机制中，目的蛋白并不直接改变核心蛋白活性，而是先改变外围蛋白所在位置，把外围蛋白带到新的微域，再由该微域决定核心通路的局部输出。

相关文献：Brar KK, et al. PERK-ATAD3A interaction provides a subcellular safe haven for protein synthesis during ER stress. Science. 2024;385:eadp7114.

这篇文献报道，ATAD3A 与 PERK 结合后，在线粒体—内质网接触位点形成局部保护性平台，使 ER stress 下的线粒体相关蛋白翻译获得保留。按结构拆解，目的蛋白是 ATAD3A，外围蛋白是 PERK，核心蛋白是 eIF2α 相关翻译抑制输出轴，目的蛋白介导的动作是改变外围蛋白的亚细胞定位和局部作用区室，建立新的接触位点微域，从而重塑核心输出。

相关文献：Wang X, Xu P, Bentley-DeSousa A, et al. The bridge-like lipid transport protein VPS13C/PARK23 mediates ER-lysosome contacts following lysosome damage. Nat Cell Biol. 2025.

这篇文献报道，VPS13C 在溶酶体损伤后被快速招募到内溶酶体表面，参与建立 ER-lysosome contacts。按结构拆解，目的蛋白是 VPS13C，外围蛋白是接触位点组织因子如 VAP 相关模块，核心蛋白/核心过程是 ER-lysosome contact-dependent membrane repair and homeostasis，目的蛋白介导的动作是改变外围蛋白汇聚位置，建立新的细胞器接触微域。

这一类机制最适合线粒体、ER、溶酶体、内体、核膜和细胞器接触位点定位的目的蛋白。实操上要把定位作为主线，用超分辨、亚细胞分馏、接触位点标记和动态刺激模型来推进。

4.6 改写外围蛋白介导的内吞—回收—降解命运分叉

这一类机制中，目的蛋白通过外围分选蛋白，决定某个受体或信号组件究竟进入回收、持续信号还是降解路径，从而影响核心通路的持续时间和输出质量。

相关文献：Zanin N, Viaris de Lesegno C, Podkalicka J, et al. STAM and Hrs interact sequentially with IFN-alpha receptor to control spatiotemporal JAK-STAT endosomal activation. Nat Cell Biol. 2023;25(3):425-438.

这篇文献报道，IFNAR 在不同阶段先后与 STAM 和 Hrs 互作，控制 JAK-STAT 信号在质膜和早期内体之间的时空转换。按结构拆解，目的蛋白可以对应 STAM 或 Hrs 这类分选层调控因子，外围蛋白是 IFNAR，核心蛋白是 JAK1/TYK2-STAT1/STAT2 轴，目的蛋白介导的动作是改写外围蛋白的内吞后命运分叉，使其在不同区室产生不同持续时间的核心信号。

相关文献：Blouin CM, Hamon Y, Gonnord P, et al. Spatiotemporal control of interferon-induced JAK/STAT signalling and gene transcription by the retromer complex. Nat Commun. 2016;7:13476.

这篇文献报道，retromer complex 参与调控 IFN 受体内吞后的时空分选，决定 JAK/STAT 信号持续时间和下游基因转录。按结构拆解，目的蛋白对应 retromer 复合体中的分选调节成分，外围蛋白是 IFNAR，核心蛋白是 JAK/STAT 信号轴，目的蛋白介导的动作是控制外围蛋白的回收或持续内体信号化命运。

这一类机制最适合膜面、早期内体、回收内体、MVB 和溶酶体定位的目的蛋白。实操上要把时间梯度 phospho-readout、pulse-chase、表面生物素化和内吞回收测定作为主线。

4.7 改变外围蛋白聚簇、驻留时间或凝聚体组分

这一类机制中，目的蛋白不一定改变外围蛋白总量，而是改变其在局部空间中的聚簇几何、驻留时间或凝聚体组分，从而改变核心信号的放大效率。

相关文献：Chan S, Belmar N, Ho S, et al. An anti-PD-1-GITR-L bispecific agonist induces GITR clustering-mediated T cell activation for cancer immunotherapy. Nat Cancer. 2022;3:337-354.

这篇文献报道，GITR 的强效活化并不只取决于是否结合配体，而取决于是否形成合适的高阶 clustering。按结构拆解，目的蛋白可类比为促进聚簇的组织因子，外围蛋白是 GITR，核心蛋白/核心过程是下游 T cell activation signalling module，目的蛋白介导的动作是改变外围蛋白聚簇状态，提高核心信号激活效率。

相关文献：Case LB, Zhang X, Ditlev JA, Rosen MK. Stoichiometry controls activity of phase-separated clusters of actin signaling proteins. Science. 2019;363(6431):1093-1097.

这篇文献报道，凝聚体中不同组分的化学计量比和驻留时间会显著影响 actin signalling 输出。按结构拆解，目的蛋白可对应改变凝聚体配方的组织因子，外围蛋白是 Nck/N-WASP 等凝聚体组件，核心蛋白/核心过程是 actin assembly 模块，目的蛋白介导的动作是改变外围蛋白在凝聚体中的组分比例和驻留时间，进而影响核心输出。

这一类机制多见于膜面、免疫突触、黏着斑、核斑和应激颗粒附近的目的蛋白。实操上建议加入 FRAP、单粒子追踪、cluster quantification 和 dwell time 分析。

4.8 通过外围蛋白重塑胞外通讯或受体起始条件

这一类机制中，目的蛋白本身虽然没有明确胞内功能，但通过与外围蛋白结合，改变胞外配体、膜面受体或起始条件，最终改写核心通路。

相关文献：Zhou T, Damsky W, Weizman OE, et al. IL-18BP is a secreted immune checkpoint and barrier to IL-18 immunotherapy. Nature. 2020;583(7817):609-614.

这篇文献报道，IL-18BP 作为可溶性诱饵结合 IL-18，限制其激活效应细胞。按结构拆解，目的蛋白是 IL-18BP，外围蛋白是 IL-18，核心蛋白是 IL-18R 及其下游免疫激活轴，目的蛋白介导的动作是通过结合外围蛋白进行胞外中和，降低核心通路的起始输入。

相关文献：Li H, Wang X, Wang Y, et al. Secreted LRPAP1 binds and triggers IFNAR1 degradation to facilitate virus evasion from cellular innate immunity. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:374.

这篇文献报道，分泌型 LRPAP1 可直接结合 IFNAR1 并触发其降解。按结构拆解，目的蛋白是 secreted LRPAP1，外围蛋白是 IFNAR1，核心蛋白是 JAK1/TYK2-STAT1/2 轴，目的蛋白介导的动作是通过作用于外围蛋白受体本体，改变核心通路的起始条件并使核心信号下调。

这一类机制适合信号肽阳性、分泌型、膜面型或微环境相关目的蛋白。实操上优先考虑上清转移、重组蛋白处理、受体结合验证和阻断实验。

五、从机制反推表型：当目的蛋白本身没有功能时，如何结合通路属性和亚细胞定位设计表型

5.1 从通路属性反推表型

如果目的蛋白通过外围蛋白进入受体内吞、回收、分选或膜面聚簇相关通路，那么更优先的表型通常不是泛泛的增殖，而是受体表面保留、脱敏与再敏化、持续信号时长、迁移与趋化、药物响应和免疫检查点稳定性。此时应优先安排时间梯度的通路 readout、表面蛋白追踪、流式检测、迁移侵袭和药物敏感性实验。

如果目的蛋白通过外围蛋白进入 ER stress、线粒体稳态、细胞器接触位点或局部翻译平台相关通路，那么更优先的表型通常是应激耐受、ROS、水解和氧化损伤抵抗、Ca2+ 稳态、膜电位、能量代谢和死亡方式切换。此时可优先安排 ROS、线粒体膜电位、OCR/ECAR、Ca2+ flux、应激存活和死亡分型实验。

如果目的蛋白通过外围蛋白进入核转位、共激活、染色质重塑或核内停留相关通路，那么更优先的表型通常是状态转换、分化重编程、EMT、干性、耐药程序和长期转录输出改变。此时应优先安排核质分离、RNA-seq/qPCR panel、克隆形成、球形成和长期诱导模型。

如果目的蛋白通过外围蛋白进入胞外通讯、细胞因子中和、免疫检查点或受体起始条件控制相关通路，那么更优先的表型通常是免疫细胞活化、浸润、细胞毒性、旁分泌通讯、感染抵抗和治疗应答，而不是先做肿瘤细胞内在增殖。此时更适合用共培养、上清转移、ELISA、趋化和杀伤实验。

5.2 从亚细胞定位反推表型

定位在质膜和膜近端的目的蛋白，优先反推受体占用、膜面聚簇、信号阈值、黏附和迁移相关表型。

定位在早期内体、回收内体、MVB 或溶酶体附近的目的蛋白，优先反推受体命运分叉、信号持续时间、脱敏、再敏化和治疗耐受相关表型。

定位在线粒体、内质网或细胞器接触位点的目的蛋白，优先反推代谢稳态、应激耐受、局部翻译、膜损伤修复和死亡方式转换相关表型。

定位在细胞核和核周的目的蛋白，优先反推转录程序、细胞命运转换、干性和耐药表型。

定位在胞外或分泌系统中的目的蛋白，优先反推细胞间通讯、免疫微环境和旁分泌效应相关表型。

5.3 从“动作类型”反推最优实验终点

如果动作是“形成平台”，优先看复合体装配效率、局部富集、货物进入率和通路起跳效率。

如果动作是“竞争占位”，优先看竞争双方互作强弱、核心通路启动阈值和应答延迟。

如果动作是“稳定保护”，优先看蛋白半衰期、泛素化、表面驻留和持续输出。

如果动作是“招引第三者”，优先看三级复合体建立、阶段转换和推进失败点。

如果动作是“改定位”，优先看亚细胞转位、接触位点数量、局部微域建立和区室特异性输出。

如果动作是“改命运分叉”，优先看回收、降解、内体持续信号和刺激后恢复。

如果动作是“改聚簇或凝聚体”，优先看 cluster size、密度、驻留时间和单细胞快速响应。

如果动作是“改胞外通讯”，优先看配体可及性、受体表面水平、旁分泌效应和免疫应答。

5.4 从机制到表型的实操设计顺序

第一步，先锁定通路属性，是膜受体型、应激型、转录型、免疫通讯型还是代谢稳态型。

第二步，再锁定定位，是膜面、内体、细胞器、细胞核还是胞外。

第三步，把机制动作归类到平台形成、竞争占位、保护稳定、招引第三者、改定位、改命运分叉、改聚簇或改胞外通讯中的一种或两种。

第四步，再去匹配最合适的表型终点，而不是默认先做增殖、凋亡、迁移三件套。

第五步，机制和表型同步推进，避免出现机制做到很深但表型没有落点，或表型做了很多但机制链条断裂的情况。

六、研究方案整合：从差异基因到表型闭环的标准路线

第一步，建立候选池，筛选差异倍数、统计稳定性、重复性和创新空间都较合适的基因。

第二步，判断目的蛋白本体能否直接作为机制主体。如果可以，优先围绕本体功能展开；如果不行，则转向互作层。

第三步，结合定位信息开展 IP-MS，并优先筛选外围蛋白，而不是优先追核心蛋白。

第四步，把候选机制缩窄到具体动作层：形成平台、竞争占位、保护稳定、招引第三者、改变定位、改写命运分叉、改变聚簇或改写胞外通讯。

第五步，围绕动作建立验证链，不只证明“有互作”，而是证明“这个互作改写了外围蛋白的哪一种行为”。

第六步，结合通路属性和定位信息反推最优表型，优先选择最能承接机制动作的终点。

第七步，把全文最终收束为一条完整单链：目的蛋白本身功能不突出，但通过结合并改写外围蛋白的动作，重新组织了核心通路的接线方式、时空位置或持续时间，进而改变关键表型，并最终落到疾病意义或治疗意义上。

附录A 常见80个通路中核心蛋白与推荐外围蛋白清单

A1 生长因子受体与经典增殖信号通路

A1.1 EGFR 通路
核心蛋白：EGFR、ERK、AKT
推荐外围蛋白：GRB2、SHC1、CBL、EPS15、HRS

A1.2 HER2/ERBB2 通路
核心蛋白：ERBB2、PI3K、ERK
推荐外围蛋白：ERBIN、GRB7、SHC1、CBL、RAB11

A1.3 FGFR 通路
核心蛋白：FGFR1/2/3、ERK
推荐外围蛋白：FRS2、GRB2、CBL、RAB5、RAB11

A1.4 PDGFR 通路
核心蛋白：PDGFR、PI3K、PLCγ
推荐外围蛋白：SHP2、GRB2、CBL、SNX27、CAV1

A1.5 VEGFR 通路
核心蛋白：VEGFR2、PLCγ、ERK
推荐外围蛋白：NRP1、SHB、SRC、RABEP1

A2 细胞因子、先天免疫与炎症信号通路

A2.1 JAK-STAT 通路
核心蛋白：JAK1/2、STAT1/3/5
推荐外围蛋白：SOCS1、SOCS3、β-arrestin1、STAM、HRS

A2.2 IFN-I 通路
核心蛋白：IFNAR1/2、JAK1、TYK2、STAT1/2
推荐外围蛋白：USP18、STAM、HRS、VPS35、SOCS1

A2.3 IL-6 通路
核心蛋白：IL6R、gp130、JAK、STAT3
推荐外围蛋白：SOCS3、SHP2、GRB2、ADAM17、CBL

A2.4 TNF/NF-κB 通路
核心蛋白：TNFR1、IKK、NF-κB
推荐外围蛋白：TRADD、TRAF2、RIPK1、CYLD、A20

A2.5 IL-1R 通路
核心蛋白：IL1R、MyD88、IRAK、NF-κB
推荐外围蛋白：MyD88、IRAK4、TRAF6、TOLLIP、SIGIRR

A3 发育与命运决定信号通路

A3.1 Wnt/β-catenin 通路
核心蛋白：LRP5/6、DVL、β-catenin
推荐外围蛋白：AXIN、APC、CK1、RNF43、ZNRF3

A3.2 Hedgehog 通路
核心蛋白：PTCH1、SMO、GLI
推荐外围蛋白：SUFU、KIF7、GRK2、β-arrestin2、EVC/EVC2

A3.3 Notch 通路
核心蛋白：NOTCH、γ-secretase、NICD、CSL
推荐外围蛋白：NUMB、MAML、FBXW7、Deltex、ADAM10

A3.4 TGF-β/SMAD 通路
核心蛋白：TGFBR1/2、SMAD2/3、SMAD4
推荐外围蛋白：SMAD7、SARA、SMURF2、USP15、Endofin

A3.5 Hippo 通路
核心蛋白：MST1/2、LATS1/2、YAP/TAZ
推荐外围蛋白：SAV1、MOB1、AMOT、NF2、α-catenin

A4 细胞死亡、自噬与蛋白稳态通路

A4.1 内源性凋亡通路
核心蛋白：BAX、BAK、Caspase-9
推荐外围蛋白：BCL2、MCL1、BIM、BID、VDAC2

A4.2 坏死性凋亡通路
核心蛋白：RIPK1、RIPK3、MLKL
推荐外围蛋白：c-FLIP、Caspase-8、TRAF2、CYLD、A20

A4.3 焦亡通路
核心蛋白：Caspase-1、GSDMD
推荐外围蛋白：ASC、NEK7、GBP5、P2X7、NINJ1

A4.4 铁死亡通路
核心蛋白：GPX4、SLC7A11、ACSL4
推荐外围蛋白：FSP1、NCOA4、TFRC、ALOX15、NRF2

A4.5 UPR/内质网应激通路
核心蛋白：PERK、IRE1α、ATF6
推荐外围蛋白：BIP、ATAD3A、TRAF2、ERO1L、P58IPK

A5 细胞周期、DNA 损伤与基因组稳定性通路

A5.1 G1/S 通路
核心蛋白：Cyclin D-CDK4/6、RB、E2F
推荐外围蛋白：p16、p21、p27、SKP2、CDC37

A5.2 DNA damage checkpoint 通路
核心蛋白：ATM、ATR、CHK1、CHK2
推荐外围蛋白：MDC1、53BP1、TOPBP1、CLASPIN、RNF8

A5.3 p53 通路
核心蛋白：p53
推荐外围蛋白：MDM2、MDMX、ARF、USP7、53BP1

A6 代谢、能量与应激适应通路

A6.1 PI3K-AKT-mTOR 通路
核心蛋白：PI3K、AKT、mTOR
推荐外围蛋白：IRS1、GRB10、Raptor、Deptor、TSC1/2

A6.2 AMPK 通路
核心蛋白：AMPK
推荐外围蛋白：LKB1、CAMKK2、AXIN、TBC1D1、Raptor

A6.3 HIF-1 通路
核心蛋白：HIF1α、ARNT
推荐外围蛋白：PHD2、VHL、FIH、CBP/p300、RACK1

A6.4 NRF2 通路
核心蛋白：NRF2
推荐外围蛋白：KEAP1、CUL3、p62、βTrCP、DJ-1

A7 黏附、迁移、骨架与细胞间通讯通路

A7.1 Integrin-FAK 通路
核心蛋白：Integrin、FAK、SRC
推荐外围蛋白：Talin、Kindlin、Paxillin、Vinculin、Caveolin-1

A7.2 RhoA-ROCK 通路
核心蛋白：RhoA、ROCK
推荐外围蛋白：GEF-H1、p190RhoGAP、mDia、LARG

A7.3 Rac1/Cdc42 通路
核心蛋白：Rac1、Cdc42、PAK
推荐外围蛋白：TIAM1、DOCK1、IQGAP1、NCK、WAVE complex

A7.4 TCR 通路
核心蛋白：TCR/CD3、LCK、ZAP70
推荐外围蛋白：LAT、SLP76、PAG/Cbp、Cbl-b

A7.5 Immune checkpoint 通路
核心蛋白：PD-1、PD-L1、CTLA4
推荐外围蛋白：SHP2、CMTM6、FBXO38、AP2、Rab11

A8 转录、RNA 与表观调控相关通路

A8.1 NF-κB 核转位通路
核心蛋白：RelA/p50、IKK
推荐外围蛋白：IκBα、CRM1、β-TrCP、NEMO、p28GANK

A8.2 STAT 核功能通路
核心蛋白：STAT1/3
推荐外围蛋白：β-arrestin1、TC45、PIAS、importin α/β、CRM1

A8.3 ERα 通路
核心蛋白：ERα
推荐外围蛋白：SRC3、P300、FOXA1、Cyclin D1、MDM2

A8.4 YAP/TAZ 核转录通路
核心蛋白：YAP、TAZ、TEAD
推荐外围蛋白：AMOT、14-3-3、VGLL4、SWI/SNF、SRC

附录B 根据研究目的推荐实验平台与配套应用场景指南

B1 总原则：先问问题类型，再选平台

表达变化优先考虑 WB、qPCR、ELISA。
空间定位优先考虑 IF、IHC、细胞器分馏。
蛋白—蛋白互作优先考虑 Co-IP、pull-down、BiFC、proximity labeling。
蛋白—核酸互作优先考虑 ChIP、EMSA、RIP、CLIP。
动态命运分叉优先考虑 pulse-chase、表面生物素化、内吞回收实验。
稳定性与降解优先考虑 CHX chase、泛素化检测、抑制剂救援实验。
聚簇与凝聚体优先考虑超分辨、FRAP、单粒子追踪和 cluster quantification。

B2 表达检测类平台

B2.1 Western blot
适合检测总蛋白、修饰蛋白、裂解片段、半衰期和通路激活状态。

B2.2 qPCR
适合验证差异基因、靶基因转录输出和干预是否起效。

B2.3 ELISA
适合检测分泌型蛋白、细胞因子、趋化因子和上清变化。

B3 空间定位类平台

B3.1 免疫荧光
适合核转位、膜定位、内体转运、细胞器共定位和局部聚簇观察。

B3.2 免疫组化
适合临床样本、组织分层、病理评分和大队列表达验证。

B3.3 原位杂交
适合 RNA 空间表达、细胞群定位和旁分泌来源判定。

B4 蛋白—蛋白互作类平台

B4.1 Co-IP
适合验证细胞内同一复合体关系。

B4.2 pull-down
适合验证直接结合和结构域映射。

B4.3 BiFC / proximity labeling
适合验证互作发生位置和邻近依赖性。

B5 蛋白—核酸互作类平台

B5.1 ChIP
适合验证蛋白对启动子或增强子的占位。

B5.2 EMSA
适合验证序列依赖性的直接 DNA 结合。

B5.3 RIP / CLIP
适合验证 RNA 结合及其位点分辨。

B6 不同研究目的的组合建议

证明“目的蛋白与外围蛋白存在互作”：Co-IP + pull-down + IF/定位。
证明“目的蛋白改变外围蛋白稳定性”：CHX chase + 泛素化 + 抑制剂救援。
证明“目的蛋白改变外围蛋白定位”：IF + 亚细胞分馏 + 动态刺激模型。
证明“目的蛋白改变外围蛋白命运分叉”：表面追踪 + 内吞回收 + 时序通路 readout。
证明“目的蛋白改变外围蛋白聚簇”：超分辨 + FRAP + 单分子/单细胞分析。

附录C 相关生信工具网站与指导性使用建议

C1 总则

生信网站不是信息堆砌工具，而是机制研究中用于定义对象、判断定位、筛外围蛋白、搭建局部网络、验证表达背景和扩展疾病意义的证据分层工具。

C2 蛋白基础信息优先站：UniProt
适合判断蛋白类型、亚细胞定位、结构域、修饰位点和加工片段。

C3 人类基因整合站：GeneCards
适合快速查看基因背景、别名、疾病关联和通路概览。

C4 蛋白关联网络站：STRING
适合从候选蛋白出发寻找外围节点和局部网络模块。

C5 标准基因信息站：NCBI Gene
适合统一命名、转录本编号和标准 ID。

C6 转录本与变异优先站：Ensembl
适合外显子、转录本、变异位点和跨数据库映射分析。

C7 正常组织表达背景站：GTEx
适合判断候选基因在正常组织中的基线表达和组织偏好。

C8 蛋白表达与亚细胞定位站：Human Protein Atlas
适合查看组织表达、细胞类型偏好和亚细胞定位。

C9 肿瘤队列与临床外延站：cBioPortal
适合查看突变、拷贝数、表达变化和部分临床关联。

C10 人类遗传表型站：OMIM
适合从基因连接人类表型和遗传病背景。

C11 基因组位点可视化站：UCSC Genome Browser
适合查看启动子、增强子、轨道信号和自定义数据。

C12 通路事件精细化站：Reactome
适合把大通路进一步细化到具体事件层。

C13 经典通路图谱站：KEGG
适合做组学富集的大方向判断和图谱展示。

C14 体细胞突变知识库：COSMIC
适合肿瘤背景中的突变热点和功能变异线索。

C15 细胞系模型选择站：CCLE
适合选择高表达、低表达和背景合适的实验模型。

C16 依赖性分析站：DepMap
适合评估候选基因是否为癌细胞依赖节点。

C17 公共表达与表观组数据库：GEO
适合做外部验证、独立队列支持和条件复核。

C18 肿瘤免疫浸润分析站：TIMER
适合做免疫浸润和微环境初筛。

C19 肿瘤与正常表达对比站：GEPIA
适合快速查看表达差异、分期和预后关联。

C20 功能富集站：DAVID
适合中等规模差异基因列表的功能归类。

C21 现代富集与 ID 转换站：g:Profiler
适合多 ID 体系、跨物种和现代化富集分析。