南京博恩生物技术有限公司面向高校、科研院所、医药企业与生物技术企业，提供从方案评估、抗体筛选、样本处理、荧光染色、共聚焦成像到结果分析的一站式免疫荧光实验外包服务。服务覆盖细胞免疫荧光、组织免疫荧光、石蜡切片免疫荧光、冰冻切片免疫荧光、单标染色、多色共定位染色、核转位分析、细胞骨架观察、亚细胞定位分析及发表级图版输出。

免疫荧光是一种利用荧光标记抗体检测细胞或组织中目标蛋白表达、分布和定位的技术，适用于观察蛋白在细胞和组织中的空间分布、亚细胞定位、核转位及多重共定位。相较于免疫组化，免疫荧光更适合细胞水平和亚细胞水平的精细定位分析；相较于 Western blot，免疫荧光虽然不提供条带和分子量信息，但更擅长回答“蛋白位于哪里”“是否进入细胞核”“两个蛋白是否共定位”“细胞形态是否发生改变”等关键问题。该技术不仅可视化蛋白空间分布，也有助于理解蛋白运输、定位变化及其在复杂细胞通路中的作用。

项目交付内容包括原始荧光图、代表性视野图、单通道图、合并图、共定位分析图、统计结果图及完整中文报告。项目完成后，公司提供终身售后支持，持续响应图版整理、结果解释、投稿补充材料准备及后续相关问题。

导读

一、服务概述
二、服务定位与适用场景
三、核心优势
四、项目评估重点
五、服务流程
六、样本要求
七、交付内容与售后支持
八、周期与报价方式
九、常见问题
附录A 常见项目类型
附录B 常见研究场景的标志物设计思路
附录C 常见免疫细胞标志物
附录D 免疫荧光与其他常见实验的对比

一、服务概述

1.1 服务对象

南京博恩生物技术有限公司面向高校、科研院所、医药企业与生物技术企业，提供免疫荧光实验外包服务。服务对象覆盖基础研究、转化研究、药效评价、靶点验证、抗体应用验证、论文配图、项目申报及结题汇报等多类需求场景。

1.2 服务内容

公司可提供从方案评估、抗体筛选、样本处理、荧光染色、共聚焦成像到结果分析的一站式服务。业务范围覆盖细胞免疫荧光、组织免疫荧光、石蜡切片免疫荧光、冰冻切片免疫荧光、单标染色、多色共定位染色、核转位分析、细胞骨架观察、亚细胞定位分析及发表级图版整理。

1.3 服务价值

免疫荧光适用于观察目标蛋白在细胞或组织中的表达、分布和定位，尤其适合开展空间分布分析、亚细胞定位分析、核转位研究及多重共定位研究。该技术有助于回答目标蛋白位于何处、是否进入细胞核、是否与其他蛋白发生共定位、细胞形态是否发生变化等关键问题。项目完成后，可交付原始荧光图、代表性视野图、单通道图、合并图、共定位分析图、统计结果图及完整中文报告，并持续提供售后支持。

二、服务定位与适用场景

2.1 服务定位

本服务定位于研究型和应用型项目的免疫荧光检测支持，适用于课题机制研究、药效机制验证、靶点定位分析、抗体应用评价及空间分布研究等工作需求。

2.2 适用客户场景

高校与科研院所主要用于机制研究、细胞定位分析、论文配图及结题材料整理；医药企业主要用于药效机制验证、靶点细胞定位及通路转位分析；生物技术企业主要用于抗体应用验证、细胞表型评估及空间定位研究。

2.3 适用研究场景

免疫荧光尤其适用于目标蛋白细胞内定位分析、蛋白核转位研究、膜蛋白分布分析、细胞骨架观察、线粒体定位研究、溶酶体定位研究、内质网定位研究、双标或多标共定位分析、细胞分化鉴定、神经细胞标志物鉴定、肿瘤干性研究、免疫细胞表型分析及药物处理前后细胞表型变化比较等研究方向。

三、核心优势

3.1 围绕研究问题开展方案设计

公司以研究目的为中心开展实验设计，可根据客户关注的问题制定更有针对性的检测方案。例如，针对目标蛋白是否入核、是否定位于膜结构、是否与另一蛋白共定位、药物处理后细胞骨架或形态是否发生变化等问题，可分别优化实验路径与检测重点。

3.2 具备复杂样本处理能力

针对细胞样本、石蜡切片、冰冻切片、新鲜组织及固定细胞等不同样本类型，可结合目标蛋白特点和样本状态优化处理流程。对于核蛋白、膜蛋白、细胞骨架蛋白及细胞器相关蛋白等对固定、透化和背景控制要求较高的项目，可进行针对性优化，以提升实验成功率和图像质量。

3.3 具备多色共染与通道优化能力

对于双标或多标共定位项目，可在实验前评估一抗来源种属、荧光通道组合及发射光谱重叠风险，降低串色和交叉反应风险。对于复杂共定位项目，还可结合共聚焦成像提升定位判断的准确性。

3.4 具备结果分析与发表级输出能力

除常规成像外，公司还可根据项目需求开展荧光强度分析、阳性细胞比例分析、核转位分析及共定位系数分析，并输出单通道图、合并图、统计图及发表级图版整理结果。交付内容可直接服务于课题研究、论文配图、项目申报、结题汇报及内部技术报告。

3.5 提供全过程技术支持

项目从前期方案评估开始，直至完整报告交付后，均提供持续技术支持。项目完成后，仍可围绕结果解释、图版修改、投稿补充材料准备及后续问题处理提供长期服务，提升成果使用效率。

四、项目评估重点

4.1 目标蛋白是否适合采用免疫荧光检测

不同研究问题对应的技术路径有所差异。对于强调蛋白分子量、条带特异性或修饰状态的项目，Western blot 可能更合适；对于强调组织病理背景的项目，免疫组化可能更合适。公司可结合研究目的对技术路线进行前期判断，帮助客户选择更匹配的方法。

4.2 样本处理方式是否影响抗原暴露与图像质量

不同样本类型对固定方式、固定时间、透化强度及封闭体系的敏感性不同。尤其是核蛋白、膜蛋白及细胞骨架蛋白，对处理条件更为敏感。项目评估阶段将结合目标蛋白和样本特点优化相关参数。

4.3 是否存在一抗种属冲突或二抗交叉反应风险

双标或多标实验若一抗种属设计不合理，容易出现二抗交叉反应或染色结果混淆。公司会在前期评估一抗来源种属及检测体系，必要时调整抗体组合或建议替代方案。

4.4 是否存在荧光串色或背景干扰风险

多色染色项目需重点考虑荧光通道设计、自发荧光背景、组织背景干扰及信号强弱差异。组织样本通常对自发荧光控制和背景封闭提出更高要求，前期评估有助于降低后续成像难度。

4.5 是否需要共聚焦成像或定量分析

不同研究目的对图像精度和分析深度要求不同。若项目涉及细胞器共定位、核转位分析、亚细胞精细定位或高质量发表图需求，通常建议结合共聚焦成像及后续定量分析。

五、服务流程

5.1 客户提交资料

客户提交研究目的、目标蛋白、样本类型、物种信息、分组设计、处理条件及参考资料等基础信息。

5.2 方案评估

根据样本类型和研究目的，评估项目是否适合开展免疫荧光实验，并确认细胞样本、石蜡切片或冰冻切片的实施方案，同时评估抗体应用、固定透化条件、封闭体系及荧光染料组合。

5.3 问题反馈与方案优化

对方案中可能存在的问题进行反馈和优化，例如一抗种属冲突、二抗荧光串色风险、共定位组合不合理，或研究问题更适合采用其他实验方法等。

5.4 正式报价

根据样本数量、检测指标数量、单标或多标方案、是否需要共聚焦成像、是否需要定量分析以及是否需要发表级图版整理等因素出具正式报价。

5.5 签订合同并支付预付款

双方确认合作内容、项目周期及交付标准后签订合同，并支付预付款。

5.6 开展实验

项目进入样本固定、透化、封闭、一抗孵育、二抗荧光标记、复染、封片、显微成像与结果分析等流程。

5.7 提交阶段性结果

实验完成后，先提交 PDF 版结果报告供客户确认。

5.8 支付尾款并交付终版成果

尾款支付完成后，提交完整终版报告、原始图、单通道图、合并图、统计图及整理后的发表素材。

六、样本要求

6.1 总体要求

免疫荧光实验对样本状态、固定方式、透化条件及荧光背景控制要求较高，不同样本类型需满足相应要求。送样前建议充分沟通样本来源、处理方式及目标蛋白特点，以提高实验成功率和结果稳定性。

6.2 贴壁细胞爬片

要求细胞状态良好、密度适中、贴壁完整，适用于常规细胞免疫荧光实验。一般可常温短途运输，或按约定完成固定后运输。

6.3 细胞沉淀

建议提供活细胞或沉淀样本，由公司统一铺片，适用于悬浮细胞或需统一制片的项目。运输通常采用低温条件，并尽快处理。

6.4 石蜡切片

建议使用防脱载玻片，切片厚度通常为3–5 μm，适用于组织免疫荧光实验。运输时一般采用常温避潮方式。

6.5 冰冻切片

建议新鲜制片并避免反复冻融，适用于对固定较为敏感的抗原检测。运输时一般采用干冰条件。

6.6 新鲜组织样本

可提供新鲜组织用于统一包埋与切片，适合需统一处理条件的项目。运输方式可根据项目要求采用低温或固定液条件，并建议提前沟通。

6.7 固定细胞样本

需明确说明固定剂类型及固定时间。固定条件会直接影响抗原暴露和背景信号，因此建议在送样前充分沟通。运输方式可根据方案要求选择低温或常温。

6.8 需同步提供的信息

除样本外，建议同时提供目标蛋白名称、物种、分组设计、处理条件、目标定位、参考文献以及是否涉及共定位分析等信息，以便更准确地确定抗体与荧光方案。

6.9 样本处理说明

细胞定位实验应尽量保持细胞形态完整；核蛋白、膜蛋白及细胞骨架蛋白对固定与透化条件较敏感；组织免疫荧光实验对自发荧光控制和背景封闭要求更高；多色共定位实验需提前规划荧光通道和一抗种属。

七、交付内容与售后支持

7.1 标准交付内容

项目交付内容通常包括中文版实验报告、样本信息、抗体信息、实验方法、固定与透化条件、封闭体系、染料信息、拍照参数、图注、结果描述、结论总结，以及原始荧光图、单通道图、合并图、共定位分析图、荧光强度统计图、阳性细胞比例分析图、发表级整理图版及完整终版报告。

7.2 交付形式

标准交付通常包括样本与抗体信息、方法学描述、固定透化与封闭参数、原始荧光图片、单通道图、合并图、共定位分析图、荧光强度统计图、发表级图版整理及完整终版报告。

7.3 成果使用支持

如客户有论文发表、项目申报或结题汇报需求，可进一步结合用途进行图版整理与结果表达优化，提高成果使用效率。

7.4 售后支持

项目完成后，公司可持续提供结果解释、图版整理、投稿补充材料准备及后续相关问题答复等服务。

八、周期与报价方式

8.1 项目周期

常规免疫荧光项目周期通常为20–40个工作日。若项目涉及多色共染、共聚焦成像、抗体筛选、荧光通道优化、重复实验、复杂统计分析或发表级图版整理，整体周期将相应延长。

8.2 报价影响因素

报价主要受样本数量、检测指标数量、单标或多标方案、是否需要共聚焦成像、是否开展共定位分析、是否进行荧光强度定量、是否需要发表级图像整理，以及是否涉及特殊物种、特殊抗体或特殊荧光通道等因素影响。

九、常见问题

9.1 免疫荧光适合解决什么问题

免疫荧光更适合回答目标蛋白位于细胞何处、是否位于细胞核、胞浆或细胞膜、是否与另一蛋白发生共定位、药物处理后是否发生核转位，以及细胞骨架或形态是否发生变化等问题。

9.2 免疫荧光和免疫组化的区别是什么

免疫荧光更适合细胞水平、亚细胞水平和多色共定位分析；免疫组化更适合组织病理背景下的定位观察和常规明场分析。

9.3 免疫荧光和 Western blot 的区别是什么

免疫荧光用于定位和共定位分析，强调空间分布；Western blot 用于蛋白大小、条带特异性及修饰状态分析，强调蛋白分离后的特异检测。

9.4 双标或多标实验如何降低串色和交叉反应风险

通常优先选用不同种属来源的一抗，再分别搭配不同荧光通道的二抗；必要时可采用交叉吸附二抗，以降低交叉反应风险。

9.5 结果是否可直接用于发表

项目交付内容包括原始图、单通道图、合并图、统计图、图注说明及发表级整理图版，可直接用于论文配图、结题材料和项目汇报。

附录A 常见项目类型

A1 蛋白亚细胞定位分析

用于判断目标蛋白主要位于细胞核、胞浆、细胞膜或特定细胞器中，适用于机制研究和定位验证。

A2 核转位与膜转位研究

用于观察药物处理、刺激干预或信号激活后，目标蛋白是否发生胞浆向胞核、胞核向胞浆或膜定位变化。

A3 双标或多标共定位分析

用于判断两个或多个蛋白是否位于相同亚细胞区域，常用于细胞器定位、信号通路关系研究及复合物相关研究。

A4 细胞骨架与形态学变化观察

用于观察微丝、微管及细胞骨架重构，适用于迁移、损伤修复、药物作用及形态变化研究。

A5 组织标志物鉴定与定位分析

适用于组织样本中标志物表达位置、区域分布及组织结构背景下的定位分析。

A6 免疫细胞浸润与表型分析

适用于肿瘤、炎症及组织微环境研究，可用于观察免疫细胞浸润、亚群分布及极化倾向。

A7 药物处理前后表型比较

用于比较药物、刺激因子或处理条件前后细胞定位、形态、信号及共定位变化。

附录B 常见研究场景的标志物设计思路

B1 总体说明

在不同研究方向中，标志物的选择应结合研究对象、目标蛋白定位、样本物种及实验目的综合判断。以下内容按应用场景展开，便于在方案设计阶段快速匹配研究问题与常用标志物组合。

B2 血管相关研究

B2.1 血管生成分析

血管内皮细胞常选用 CD31、CD34、vWF 作为基础标志物，定位多位于细胞膜或胞浆。若需评估血管成熟度，可进一步联合 α-SMA、NG2 或 Desmin 观察周细胞及平滑肌覆盖情况。

B2.2 血管通透性与内皮屏障研究

常用 VE-cadherin、ZO-1、Claudin-5、Occludin 评估细胞连接完整性，适合血脑屏障、炎症损伤及药物作用研究。若关注内皮激活状态，可增加 ICAM-1、VCAM-1 辅助分析。

B2.3 淋巴管生成研究

淋巴内皮细胞常用 LYVE1、Podoplanin、PROX1、VEGFR3 等标志物，适用于肿瘤淋巴转移、炎症水肿及组织修复相关研究。

B3 细胞命运与应激研究

B3.1 细胞增殖分析

Ki-67 是常用增殖标志物，主要定位于细胞核。若需评估 DNA 合成活性，可增加 PCNA 或 EdU 相关检测联合判断。

B3.2 细胞凋亡分析

Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP 常用于检测凋亡执行阶段；Bax、Bcl-2 可用于辅助观察凋亡相关通路变化，适合药物诱导损伤、肿瘤治疗反应和细胞应激研究。

B3.3 细胞焦亡分析

常用 GSDMD、Cleaved Caspase-1、NLRP3、IL-1β 评估焦亡相关变化。若研究炎症小体活化或免疫炎症损伤，建议联合免疫细胞标志物开展分析。

B3.4 细胞自噬分析

LC3B、p62、Beclin-1 是常见组合。LC3 puncta 形成和 p62 累积常用于判断自噬流变化，适用于肿瘤、神经退行性疾病及缺血损伤研究。

B3.5 衰老表型分析

p16、p21、γH2AX、Lamin B1 常用于评估细胞衰老和 DNA 损伤相关改变。若研究复制衰老、治疗诱导衰老或纤维化进程，可与增殖、炎症标志物联合分析。

B4 细胞身份与分化研究

B4.1 上皮细胞鉴定

E-cadherin、Pan-CK、CK8、CK18、EpCAM 是常用组合，适用于上皮来源确认及上皮结构完整性观察。不同组织来源可进一步替换为相应细胞角蛋白亚型。

B4.2 EMT 研究

EMT 研究常联合 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Twist 等标志物分析。建议将上皮标志物和间质标志物分通道检测，以提升定位判读和变化解释的清晰度。

B4.3 成纤维细胞与肌成纤维细胞研究

Vimentin、FSP1、FAP、α-SMA 是常见组合。若研究纤维化或肿瘤基质重塑，建议将 α-SMA 与胶原沉积或细胞外基质相关标志物联合观察。

B4.4 细胞外基质与纤维化研究

Collagen I、Collagen III、Fibronectin、Laminin、Tenascin-C 可用于细胞外基质重塑与纤维化程度观察，适用于肝、肺、肾、心肌及肿瘤基质相关研究。

B5 神经系统相关研究

B5.1 神经元鉴定

NeuN、MAP2、βIII-Tubulin 是神经元常用标志物。若研究神经突起、树突结构或成熟状态，可根据需要增加 Synapsin、PSD95 等突触相关标志物。

B5.2 星形胶质细胞研究

GFAP 是经典星形胶质细胞标志物，AQP4、S100β 常作为补充，适用于中枢神经系统损伤、炎症及胶质反应研究。

B5.3 小胶质细胞研究

IBA1 常用于小胶质细胞总体识别，TMEM119、P2RY12 更适合提高中枢驻留小胶质细胞特异性。若需分析活化状态，可结合 CD68、MHC II 或形态学特征综合判断。

B5.4 少突胶质细胞与髓鞘研究

Olig2、MBP、CNPase、PLP1 是常见组合，适用于脱髓鞘、再髓鞘化和发育性神经研究。

B5.5 神经干细胞与祖细胞研究

Nestin、SOX2、Musashi-1 常用于神经干细胞及祖细胞识别。若需区分分化阶段，可进一步联合 DCX 或成熟神经元标志物进行分层分析。

B6 干细胞与肿瘤相关研究

B6.1 干细胞与多能性研究

SOX2、OCT4、NANOG 是多能性研究中的核心核定位标志物。该类标志物对固定和透化条件较敏感，适用于 iPSC、ESC 及干性维持相关研究。

B6.2 肿瘤干性研究

SOX2、CD133、ALDH1、OCT4 常用于肿瘤干性表型分析。实际设计中常与 Ki-67、EMT 标志物或耐药相关标志物联合，以增强结果解释力。

B6.3 缺氧应答研究

HIF-1α、CA9、GLUT1 是常见组合，适合肿瘤低氧、缺血损伤和代谢重编程研究。HIF-1α 对样本处理时间较敏感，固定与取材节奏需提前控制。

B6.4 氧化应激与线粒体损伤研究

4-HNE、8-OHdG、SOD2、Cytochrome c 可用于评估氧化损伤与线粒体应激。若研究线粒体膜电位或凋亡联动，可与 TOM20、COX IV、Cleaved Caspase-3 联合分析。

B7 细胞器定位研究

B7.1 线粒体定位研究

TOM20、COX IV、ATP5A 是常用线粒体标志物，适用于细胞器共定位、线粒体形态和分布变化研究。若与自噬联动分析，可进一步结合 LC3B 或 Parkin。

B7.2 溶酶体定位研究

LAMP1、LAMP2、Cathepsin D 常用于溶酶体结构与功能观察，适用于自噬、吞噬及药物胞内转运相关研究。

B7.3 内质网定位与应激研究

Calnexin、PDI、GRP78、CHOP 是常用组合，适用于蛋白折叠、内质网应激及 UPR 通路研究。

B7.4 高尔基体定位研究

GM130、Golgin-97、TGN46 可用于高尔基体分布和结构完整性分析，适用于分泌途径、膜蛋白转运和细胞极性研究。

B7.5 过氧化物酶体定位研究

PMP70、Catalase、PEX14 是常见标志物，适用于脂代谢、ROS 清除及细胞器互作研究。若研究代谢性疾病或药物损伤，可作为补充分析模块。

B8 细胞骨架与组织分化研究

B8.1 细胞骨架与迁移研究

α-Tubulin、β-Tubulin、Phalloidin-F-actin、Vinculin 常用于观察微管、微丝和黏附斑变化，适用于细胞迁移、侵袭、损伤修复和力学响应研究。

B8.2 肝细胞与肝祖细胞研究

Albumin、HNF4α 常用于成熟肝细胞鉴定，CK19、EpCAM 可用于肝祖细胞或胆管样表型分析，适用于肝分化、肝损伤及肿瘤相关研究。

B8.3 心肌细胞研究

cTnT、α-Actinin、MYH6、Connexin 43 是常用组合，适用于心肌分化、心肌损伤及肌节结构观察。

B8.4 骨与软骨分化研究

成骨研究常用 Runx2、Osteocalcin、ALP；软骨研究常用 SOX9、Collagen II、Aggrecan，适用于间充质干细胞分化、骨修复及组织工程研究。

附录C 常见免疫细胞标志物

C1 总体设计原则

免疫荧光中的免疫细胞鉴定不宜只依赖单一标志物，而应围绕“基础谱系识别—亚型细分—功能状态判断”三层逻辑进行设计。对于复杂组织样本，还应同时考虑样本物种、组织背景、自发荧光水平、细胞密度以及一抗来源种属，避免仅凭单个阳性信号得出过度结论。

C1.1 先识别谱系，再判断亚型

例如，T细胞宜先用 CD3 识别总 T 细胞，再区分 CD4 或 CD8 亚群；巨噬细胞宜先确认 CD68 或 F4/80 等基础谱系，再进一步判断 M1 或 M2 倾向。

C1.2 优先采用组合式标志物设计

复杂免疫表型通常需要“基础标志物 + 功能标志物 + 状态标志物”联合判断。例如，Treg 不宜仅看 FOXP3，Th17 不宜仅看 IL-17A，M1 或 M2 巨噬细胞也不宜只依赖单一极化标志物。

C1.3 严格区分人样本与鼠样本体系

人和小鼠在巨噬细胞、树突细胞、浆细胞样树突细胞、中性粒细胞、MDSC 甚至 NK 细胞标志物选择上均存在明显差异，设计方案时应先确定样本物种，再决定标志物组合。

C1.4 在双标或多标实验中同步考虑一抗来源种属

样本物种与一抗来源种属并非同一概念。样本为小鼠并不等同于不能使用鼠抗，但若进行双标或三标，一抗之间的来源种属组合必须便于后续二抗区分。

C2 T细胞系统

C2.1 总T细胞与基础亚群

总T细胞通常以 CD3 作为基础标志物。辅助性 T 细胞常以 CD3、CD4 组合识别；细胞毒性 T 细胞常以 CD3、CD8 组合识别。若研究杀伤功能，可在 CD8 基础上进一步加入 Granzyme B、Perforin 辅助判断。

C2.2 辅助性T细胞亚型

Th1 细胞常采用 CD4 联合 T-bet、IFN-γ、CXCR3 判断；Th2 细胞常采用 CD4 联合 GATA3、IL-4、CCR4 判断；Th17 细胞更推荐采用 CD4 联合 RORγt、IL-17A、CCR6 判断。对于组织切片样本，转录因子与效应因子联合设计通常更稳妥。

C2.3 Treg

Treg 的经典组合为 CD4、FOXP3、CD25，必要时增加 CD127 low 以提高特异性。若研究肿瘤免疫微环境或抑制性表型，还可加入 CTLA-4、ICOS、CD39、CD73 或 Helios 作为补充。

C2.4 活化、记忆与耗竭T细胞

活化 T 细胞常用 CD69、CD25；记忆相关分析可结合 CD45RO、CCR7、CD62L；耗竭 T 细胞常见 PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT。此类标志物在持续激活状态下也可能升高，结果解释宜结合组织背景与其他功能指标。

C3 B细胞与浆细胞系统

C3.1 总B细胞

CD19、CD20、CD79a 是常见基础标志物，适用于 B 细胞浸润、淋巴结构及肿瘤微环境相关研究。

C3.2 生发中心与活化B细胞

若关注生发中心反应，可考虑 BCL6、CD10 等指标；若关注抗原呈递或活化状态，可结合 HLA-DR、CD86 等辅助判断。

C3.3 浆细胞

浆细胞常用 CD138、MUM1、CD38 等标志物。若研究抗体分泌相关反应，可在 B 细胞基础上区分向浆细胞分化的状态变化。

C4 NK细胞与先天淋巴样细胞

C4.1 NK细胞

人样本中，NK 细胞常以 CD3 阴性为前提，结合 CD56、NKp46、NKG2D 分析；小鼠样本中常用 NK1.1、NKp46，但需注意 NK1.1 并不适用于所有鼠品系。若研究杀伤活性，可进一步加入 Granzyme B、Perforin。

C4.2 NKT细胞

NKT 细胞常通过 CD3 与 NK 相关标志物联合识别，例如 CD3 与 NK1.1 或 CD56 联合。若研究肿瘤或肝脏免疫微环境，可作为补充分析亚群。

C4.3 ILC

先天淋巴样细胞在复杂炎症和屏障组织研究中逐渐受到关注。若需开展 ILC 方向探索，可根据研究目的考虑 CRTH2、RORγt、GATA3、NKp44 等组合，但通常更适合作为专题定制项目。

C5 单核细胞与巨噬细胞系统

C5.1 单核细胞

人样本中常用 CD14、CD16 区分经典型与非经典型单核细胞；小鼠中常用 CD11b、Ly6C 区分炎症型单核细胞。若研究趋化迁移，还可增加 CCR2。

C5.2 总巨噬细胞

人样本中 CD68 是常用基础标志物，也可结合 CD163 辅助；小鼠样本中更常采用 F4/80 联合 CD68 进行识别。

C5.3 M1型极化倾向

常用 iNOS、CD80、CD86、HLA-DR 辅助判断。更稳妥的表达方式是，在总巨噬细胞标志物阳性的基础上，同时观察 M1 相关标志物升高。

C5.4 M2型极化倾向

常用 CD163、CD206、Arginase-1 等标志物。人样本更常见 CD163、CD206，小鼠样本中 Arginase-1 和 CD206 更常用。

C5.5 组织驻留与特异性巨噬细胞

在肝、肺、脑、肠等组织中，驻留巨噬细胞具有更强组织特异性。例如肝脏可考虑 CLEC4F，肺泡巨噬细胞可考虑 Siglec-F，脑组织中则需与小胶质细胞标志物区分。此类场景更适合按项目定制。

C6 树突细胞系统

C6.1 常规树突细胞

CD11c 常作为基础标志物，但不宜单独定义所有树突细胞。人样本中常结合 HLA-DR、CD1c、CLEC9A；小鼠样本中常结合 MHC II、XCR1、CLEC9A，以区分 cDC1 和 cDC2。

C6.2 浆细胞样树突细胞

人样本中常用 CD123、CD303、CD304；小鼠样本中常用 Siglec-H、CD317。该类细胞在人与鼠之间差异显著，标志物不宜直接照搬。

C6.3 成熟与活化树突细胞

若研究抗原呈递能力或成熟状态，可增加 CD80、CD86、CCR7、LAMP3 等标志物，帮助判断树突细胞是否处于活化迁移状态。

C7 粒细胞系统

C7.1 中性粒细胞

人样本中常用 CD15、CD16、MPO；小鼠中更常用 Ly6G、MPO，并视场景增加 Ly6C。由于中性粒细胞易受组织处理影响，样本固定和切片质量对结果影响较大。

C7.2 嗜酸性粒细胞

可考虑 Siglec-8、MBP、EPX 等标志物，适用于过敏、哮喘、寄生虫感染及黏膜炎症研究。

C7.3 嗜碱性粒细胞

常见标志物包括 FcεRI、CD123、CD203c。该类细胞在常规组织中数量较少，通常需结合具体疾病场景进行设计。

C8 MDSC与肿瘤免疫抑制相关细胞

MDSC 是肿瘤和慢性炎症研究中需要重点补充的免疫抑制性细胞群。人样本中常见组合为 CD11b、CD33、HLA-DR low，并根据单核型或粒细胞型倾向联合 CD14 或 CD15；小鼠样本中常用 CD11b、Gr1、Ly6C、Ly6G。由于 MDSC 定义高度依赖组合式判断，通常不建议仅凭单个标志物进行报告。

C9 肥大细胞与其他补充免疫细胞

C9.1 肥大细胞

Tryptase、Chymase、c-Kit（CD117）是常用标志物，适用于过敏、纤维化、肿瘤微环境和血管相关炎症研究。

C9.2 补充建议

若研究对象涉及特殊免疫微环境，还可进一步考虑 Tfh、MAIT、γδT 细胞、组织驻留记忆 T 细胞等更细分亚群，但此类项目通常需要更高密度的标志物组合和更明确的科学问题支撑。

附录D 免疫荧光与其他常见实验的对比

D1 与免疫组化的对比

D1.1 共同点

两者都基于抗原抗体特异性结合，均可用于组织中目标蛋白的定位分析。

D1.2 免疫荧光的优势

免疫荧光更适合细胞水平和亚细胞水平的精细定位，尤其适合双标、多标、核转位和共定位分析。对于需要区分胞核、胞浆、膜结构及细胞器分布的研究，免疫荧光通常更直接。

D1.3 免疫组化的优势

免疫组化更适合组织病理背景下的区域分布观察和常规明场阅片，图像稳定性较高，临床病理应用更成熟。

D1.4 选择建议

若研究重点为组织区域表达，免疫组化通常更适合；若研究重点为细胞内部定位与共定位关系，免疫荧光通常更有优势。

D2 与 Western blot 的对比

D2.1 Western blot 的核心特点

Western blot 通过电泳分离和转膜检测，擅长观察蛋白表达量、分子量、剪切状态、修饰状态及抗体特异性。

D2.2 免疫荧光的核心特点

免疫荧光强调空间信息，能够直接回答蛋白在细胞或组织中的定位问题，并可结合形态学背景进行分析。

D2.3 两者的互补关系

在机制研究中，Western blot 常用于验证蛋白是否上调、是否被磷酸化或剪切；免疫荧光则用于回答该蛋白是否发生入核、膜转位或细胞器定位变化。两者联合使用通常更有说服力。

D2.4 选择建议

若问题核心为蛋白总量、分子量或修饰状态变化，优先考虑 Western blot；若问题核心为空间定位和分布变化，优先考虑免疫荧光。

D3 与 ELISA 的对比

D3.1 ELISA 的优势

ELISA 适合检测上清、血清和体液中可溶性蛋白浓度变化，具有高通量、重复性好和定量能力强等特点。

D3.2 免疫荧光的优势

免疫荧光不能替代 ELISA 的高通量浓度检测，但可提供细胞和组织层面的空间分布信息。

D3.3 选择建议

若研究重点为分泌蛋白浓度变化，ELISA 更适合；若研究重点为蛋白在何种细胞或何种区域表达，免疫荧光更适合。

D4 与流式细胞术的对比

D4.1 流式细胞术的优势

流式细胞术适合高通量、单细胞、多参数分析，尤其适合免疫细胞亚群比例、阳性率和群体分布研究。

D4.2 免疫荧光的优势

免疫荧光保留组织和细胞空间结构，能够观察细胞间相对位置关系、细胞形态变化及局部微环境分布，这些信息通常难以通过流式细胞术获得。

D4.3 两者的互补关系

流式细胞术更适合回答“有多少细胞表达这一标志物”；免疫荧光更适合回答“这些细胞位于何处、彼此如何分布、是否与其他结构共定位”。

D4.4 选择建议

若研究重点为细胞比例及多参数群体分型，优先选择流式细胞术；若研究重点为空间分布、浸润位置和组织微环境关系，优先考虑免疫荧光。

D5 与 qPCR 的对比

D5.1 qPCR 的优势

qPCR 用于核酸水平检测，适合快速评估基因表达变化，具有灵敏度高、通量高等特点。

D5.2 免疫荧光的优势

免疫荧光检测的是蛋白层面，并且能够提供蛋白空间分布信息。mRNA 水平变化并不总能对应蛋白定位和蛋白活性变化。

D5.3 选择建议

若研究重点为转录水平变化，qPCR 更适合；若需要确认蛋白是否真正表达、位于何处以及是否发生定位改变，免疫荧光更具价值。

D6 方法选择的实际逻辑

如果研究问题为目标蛋白是否进入细胞核、是否与线粒体、溶酶体或内质网共定位、细胞形态是否发生变化，通常优先选择免疫荧光。
如果研究问题为蛋白总量是否升高、是否发生磷酸化或剪切、条带是否符合预期，通常优先选择 Western blot。
如果研究问题为组织病理背景下具体在哪些区域表达，通常优先考虑免疫组化或组织免疫荧光。
如果研究问题为某类免疫细胞比例是否变化，通常优先考虑流式细胞术。
如果研究问题为上清或血清中蛋白浓度是否变化，通常优先考虑 ELISA。
如果研究问题为基因转录水平是否变化，通常优先考虑 qPCR。
在较完整的机制研究中，更有说服力的方案通常采用“定量方法 + 空间定位方法”的联合设计。